三叉神经痛患者神经纤维降钙素基因相关肽的观察

　　[摘要]目的：观察三叉神经痛患者痛支与非痛支神经纤维中降钙素基因相关肽的含量变化，加深对三叉神经痛发病机理的认识。方法：用免疫组织化学 法观察16例患者痛支与非痛支神经纤维组织中降钙素基因相关肽免疫反应阳性颗粒的差异。结果：发现痛支神经组织中降钙素基因相关肽免疫反应阳性颗粒的数 量、面积均显著多于、大于非痛支神经组织中的降钙素基因相关肽免疫反应阳性颗粒。结论：我们认为：三叉神经痛的痛支神经过度合成和释放降钙素基因相关肽可 能促进了SP的释放，导致阵发性剧烈疼痛，并在局部形成神经源性炎症。
[关键词]三叉神经痛；　降钙素基因相关肽；　免疫组织化学

　　降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是1983年人类首次用分子生物学方法发现的一种由降钙素基因表达的新神经肽，广泛分布于神经、心血管、消化、呼吸、内分泌等系统，参与机体许 多功能的调节。由于CGRP与速激肽作为伤害性刺激的递质或调质共存于感觉神经元中，因此在有关疼痛的研究中引起了人们高度重视。目前的研究［1］证实三 叉神经痛发作时局部却有CGRP的参与，为了进一步研究CGRP与三叉神经痛的发病关系，我们用免疫组织化学法首次观察了16例三叉神经痛患者痛支与非痛 支神经纤维组织中降钙素基因相关肽免疫反应阳性颗粒的差异，并就其临床意义进行初步探讨。

　　材料和方法

　　一、临床资料
随机抽取16例长征医院口腔科同期住院三叉神经III支中某一支痛的患者,如仅下牙槽神经痛或颊神经痛或舌神经痛的患 者。其中男7例，女9例，年龄46-82岁，平均年龄60.5岁；左侧6例，右侧10例，下牙槽神经痛11例，舌神经痛3例，颊神经痛2例；病程6-22 年，平均10.6年。入院前所有患者均未作过手术、射频及封闭治疗，入院后均行三叉神经颅底高位切断术[2]。
二、采样方法
术中快速切取一段神经组织放入10%福尔马林固定液内，以避免人为造成的创伤给检测结果带来误差，取样部位为痛支和非痛支两处，均在第III支范围内，非痛支作为对照。标本固定后石蜡包埋、切片，片厚4μm。
三、标本制备
用ABC法[3]行免疫酶组织化学标本制备，具体步骤如下：切片脱蜡至水。 PBS液洗一遍，3min 。PBS液内用微波修复抗原1min。 PBS液洗三遍，每次3min。0.3%过氧化氢甲醇封闭过氧化物酶，室温下20min。PBS液洗三遍，每次3min。用1:10小牛血清封闭非特异性 抗原，室温下20min。加CGRP第一抗体(1:100，DaKo公司)，4℃冰箱内过夜。 PBS液洗3遍，每遍3min。加生物素化第二抗体(IgG) (1:100，DaKo公司)，37℃下45min。PBS液洗3遍，每遍3min。加ABC复合物(1:200，DaKo公司)，37℃下45min。 PBS液洗3遍，每遍3min。0.05%DAB+0.03%H2O2显色5min，免疫反应阳性颗粒呈棕色。流水洗，苏木素复染细胞核。脱水、透明、封 片、镜观。
四、观察方法
用高清晰度彩色病理图文分析系统(型号: HPIAS－1000 )分别对CGRP免疫反应阳性颗粒的数量、面积、平均光密度和平均面积进行定量分析。操作方法如下：将染色后的切片置于显微镜下，选择切片空白区校正并调 整光源和灰度，每张切片随机选择不重叠的10个视野；对所测物质准确定位后，通过摄像机将被测物的各种信息转换成数字图像，传送到主机系统，对神经纤维中 的免疫反应阳性颗粒进行二值化处理和图像修正，由主机系统自动计算出CGRP免疫反应阳性颗粒的数量、面积、平均光密度和平均面积。从数量、面积、反应强 度三个不同侧面间接反映痛支与非痛支神经纤维中CGRP的含量。所获数据按配对计量资料作t-检验。
五、统计方法
用配对资料的t-检验。
结　果
神经组织中CGRP免疫反应阳性颗粒呈棕色或棕褐色，颜色深浅不一；颗粒大小不等，形态为圆形、卵圆形及不规则形。痛支与非痛支CGRP免疫反应阳性颗 粒的数量、面积、平均光密度和平均面积见表1。经成对双样本均值t-检验分析，痛支神经纤维CGRP免疫反应阳性颗粒的数量明显多于非痛支，且相差非常显 著（P<0.01）；痛支神经纤维CGRP免疫反应阳性颗粒的面积显著大于非痛支（P<0.05）；而痛支与非痛支神经纤维CGRP免疫反应 阳性颗粒的平均光密度和平均面积相差均不显著（P>0.05）。

表1　CGRP免疫反应阳性颗粒观察值(±S, n=16)

　　讨　论

　　CGRP是1983年人类首次用分子生物学方法发现的来自降钙素（Calcitonin,CT）基因的新神经肽,在中枢神经系统的三叉神经核、 延髓及脊髓前角有大量CGRP 细胞,在外周神经系统的三叉神经节、结状神经节和脊髓背根神经节等感觉神经节内有丰富的CGRP 细胞和纤维。CGRP与多种神经递质或神经肽共存,它在神经元内合成,经轴浆运输后到达神经末梢,并以囊泡形式储存备用［4］。CGRP介导的机械性伤害 刺激传递是借助促进SP在脊髓背角释放来实现的，CGRP具有强烈的扩血管作用，并能加强速激肽增加毛细血管通透性、血浆蛋白渗出的作用，共同参与神经源 性炎症的过程［5，6］。Goadsby在对临床偏头痛和丛集性疼痛的患者研究中发现,患者颈外静脉血中CGRP含量均显著增高［7,8］。我们在对三叉 神经痛患者的临床研究中还发现，疼痛发作时患侧颈外静脉血中SP、CGRP的含量也显著升高［1，9］。这些研究表明,三叉血管系统的激活与局部CGRP 浓度的变化明显相关,三叉血管系统在脑干部位有一个反射存在,其传入神经是三叉神经,利用的神经肽为SP及CGRP,传出神经是面神经/岩浅大神经通过蝶 颚神经节和耳神经换元,利用VIP等神经肽导致血管扩张。在脊髓水平, CGRP促使痛信号的传递,当痛觉传导到中枢后又引起中枢神经系统过度分泌SP及CGRP,并沿着传出神经释放入血,引起局部血浆浓度升高。有实验证明, 脊髓蛛网膜下腔注射CGRP可使痛阈降低,而注射CGRP抗血清则可提高痛阈［4］。
本组临床资料显示：痛支神经纤维中CGRP 免疫反应阳性颗粒的数量、面积均显著多于、大于非痛支神经纤维中的CGRP 免疫反应阳性颗粒，间接反映出痛支神经纤维中的CGRP 含量比非痛支神经纤维的高，从另一个侧面反映出CGRP 在局部参与了三叉神经痛的发病过程。痛支和非痛支CGRP 免疫反应阳性颗粒的平均光密度和平均面积相差不显著表明两者在反应强度和颗粒大小上基本一致。我们认为，三叉神经痛发作时痛支神经可能快速过度合成和释放 CGRP 导致阵发性剧烈疼痛；在外周由于CGRP促进了 SP的释放，导致致痛、致炎物质的积聚，进一步刺激传导伤害性信息的传入纤维，这些刺激经过一定时间的总和后再次爆发新一轮的疼痛。我们认为：三叉神经痛 发作时局部确有CGRP的参与，其作用可能与其局部浓度升高，导致痛阈降低以及促进SP向中枢释放传递痛觉导致阵发性剧烈疼痛发作、并增强SP在外周的神 经源性炎症作用有关，而长期的神经源性炎症使得中枢释放单胺类神经递质的功能发生障碍，痛阈降低，致使颌面部轻微的触觉刺激也能产生伤害性刺激信息。由于 本组病例资料较少，还不能完满解释三叉神经痛痛支神经组织CGRP含量增多的复杂现象，只能初步说明CGRP参与了三叉神经痛疼痛发作的过程，目前还需进 一步弄清导致CGRP过度合成和释放的原因，有关研究正在深入之中。

　　参考文献

　　1.胡世辉，姜晓钟，赵云富等．三叉神经痛患者血液降钙素基因相关肽的观察［J］．口腔医学纵横，1999，15(4)∶198-199
2.姜晓钟,陈必胜,赵云富等. 三叉神经痛手术治疗-附174例报告［J］. 上海医学, 1998,21(11)∶639
3.倪荣灿．免疫组织化学实验新技术及应用［M］．第1版．北京：北京科学技术出版社，1993,128-133
4.宋朝佑，王成海．降钙素基因相关肽．见：韩济生，关新民主编，医用神经生物学［M］．武汉：武汉出版社，1996，216～219
5.华晓鹰. 感觉神经元中的神经肽及其有关的外周功能［J］. 生理科学进展, 1988, 19(4)∶304
6.王　红,杨　鲲,李云庆等. 大鼠三叉神经尾侧亚核和脊髓背角浅层内C纤维的主要神经活性物质［J］. 中国疼痛医学杂志, 1998, 4(1)∶30
7.Goadsby PJ. et al. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during mifraine headache［J］. Ann Neurol 1990， 28∶183
8.Goadsby PJ. et al. Human in vivo evidence for trigeminovascular activation in cluster headache. Neuropeptide changes and effects of acute attacks therapies［J］. Brain，1994，117∶427
9.赵云富，姜晓钟，胡世辉，等．三叉神经痛患者血液P物质及其临床意义［J］．第二军医大学学报，2000，21（1）∶95～97