组织工程的研究概况

　组织工程学是临床医生、材料工程师、化学家和生物学家共同试用细胞和生物材料创造功能性组织的新领域。“组织工程学”这个名称是1987年被正式 提出的，最早的定义是：“应用工程学和生命科学的原理和方法，认识哺乳动物正常和病理组织中结构－功能关系，并开发生物代用品，以恢复、维持或改善组织的 形态和功能”。随着组织工程学研究的深入和发展，它的内容和范围在不断扩大，近年来，有人将生物材料诱导细胞分化、组织再生亦归于组织工程学范畴，其定义 也将会有所更改。
组织工程的基本做法是：取少量自体组织，分离出某种细胞,在体外进行培养,使其扩增后，将高浓度、有活力的细胞接种到一种生 物相容性好、可生物降解而被机体吸收的、具有预制形态和空间结构的合成聚合物或天然的基质中，该材料可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞进行气体交 换，获得足够的营养物质，排除废料，使细胞在三维支架上生长。再将此细胞－支架复合物植入体内或缺损部位，在生物支架逐步降解吸收过程中，种植的细胞继续 增生繁殖、相互贴附、分泌细胞外基质，形成新的具有特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复缺损和重建功能的目的。近年来，在种子细胞、支架材料和组织 构建三个方面都有了新的发展，研究的内容不断扩大，学者们已试用各种不同的方法，研究了生物性人造软骨、骨、皮肤、粘膜、角膜、肌腱、肌、心脏瓣膜、神 经、血管、气管、小肠甚至人造肝和人造胰等组织，取得了令人鼓舞的进展和成就。
组织或器官的功能障碍或丧失，是人类健康面临的重要危害之一， 也是人类疾病和死亡的最主要原因。在美国每年有数以百万计的人患有各种组织或器官的功能障碍或丧失，需进行800万人次手术修复，年耗资超过400亿美 元。有心血管患者5800万，冠状动脉患者1400万，估计费用是美金2740亿元/年。治疗糖尿患者的估计费用每年超过美金1000亿元〔1～25〕。 美国国家健康基金委员会已将组织工程作为五大资助项目之一，并以年20%的速度递增。全世界已有近百家大公司投资和开发组织工程产品及相关设备和材料。仅 在美国从事组织工程的公司，其总资本价值已超过35亿元美金，并按年22.5% 递增。雇佣了2500多名科学家，年经费为美金4亿5千万元。估计组织工程产品总的市场潜力仅在美国是每年美金800亿元〔1〕。

　　1　组织工程学发展史及内容

　　组织工程发展的前提条件之一是细胞培养技术，即能在实验室的人工环境下使细胞生长。这是近50年间对于生物细胞性质和行为研究的重大发展。生物 细胞是任何活体的基本组成单位，具有同活体一样的两个基本功能：生长繁殖和新陈代谢，即在一定条件下，可以存活并发挥功能。细胞培养技术的出现，大大加速 了细胞生物学的进展。细胞生物学研究既有细胞的生物化学方面，也包括细胞的生物物理学方面。生物力学的工程师们已在研究许多细胞现象的力学性质，并正应用 这些力学原理来了解细胞的结构和功能。
哺乳类细胞对营养的要求很复杂，所以要想成功地培养某一特定种类的细胞，用什么介质来培养细胞就很重要。细胞培养中另一重要因素是细胞在什么表面上生长，这一表面的特性包括其超微结构和表面化学性质，可能诱发细胞的变化。
最初的“组织培养”是将绞碎的组织置于合适的营养物中，在试管内研究的。随后，将组织分离到它的功能性细胞成份，并在20世纪50年代产生了大量的细胞 培养的离体研究。最近+几年流行的是“组织培养技术”，即将细胞安排在三维结构中，研究细胞间的相互关系的体外试验；而随后的逻辑阶段是在体内再造功能性 组织。目前细胞培养技术进一步普及，CO2细胞孵箱、超净工作台及各种细胞培养液问世，使几乎所有的人体细胞均可以进行体外培养，再辅以细胞的冻存与复 苏、细胞克隆和转基因技术、对胚胎干细胞定向诱导、分化技术以及启用生物反应器（bioreactor）或灌注培养系统（perfusion culture system）培养细胞，为组织工程的发展提供了坚实的基础。

　　材料科学的发展是组织工程的必要条件，也是组织工程学研究的一个重点内容。适用于做组织工程的支架材料应具有：①良好的生物相容性；②可制备成三维立 体结构的支架材料，具有多孔性和高孔隙率，内表面积大，既有利于细胞的贴附和长入，又有利于营养成份的渗入和代谢产物的排出；③生物可降解性：材料应是可 被吸收的，在组织形成过程中逐渐分解，而不影响新生组织的结构和功能；④良好的表面活性：有利于细胞贴附，并为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好 的微环境。⑤可塑性：便于加工成所需的形状，并有一定的机械强度，在植入体内后的一定时间内仍可保持其形状，从而使新形成的组织具有所需的外形等。
关于细胞载体或细胞外基质的来源可分为人工合成的高分子聚合物和天然生物材料两大类；按其物理性状又可分为固体和液体材料两类。随着材料科学的进展，人 们已能生产出生物相容的和生物降解的材料，一些有机高分子聚合物如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及二者的共聚物(PLGA)和氯化乙烯聚丙烯腈 （polyacrylonitrile-polyvinyl chloride）等能基本上满足上述对材料特性的要求，可制备成非编织的缝线状、无纺网或泡沫状。Mikos等应用层压技术将PLA及PGA制备成具有 一定形状的三维立体聚合物泡沫，层压的各层微孔彼此相通，构成了连续孔状结构。这些都有利于细胞的长入、生存和增殖〔2〕。目前已能控制这些材料的性质， 如强度、降解性、微结构、渗透性和加工性等。材料的吸收率可以通过改变共聚单体的相关比率来控制，降解时间可以从数日到数年之久。材料的力学性能也可以通 过孔径、孔隙率及相对分子质量而加以调整。它们在体内以水解的方式降解并产生天然的中间代谢产物。PLA可被逐渐降解为水和二氧化碳，随尿和呼吸排出体 外。
天然的细胞载体是从人或动组织中提取的如胶原、骨基质明胶、珊瑚及羟基磷灰石等。液体细胞载体主要有藻酸盐水凝胶，它在室温时呈胶胨状，而在4 ℃时呈水溶液状，可利用此特性将其与细胞混合后注射到体内，形成相应的组织。也可以通过导管或内窥镜系统进行传输。

　　2　组织工程研究现状

　　2.1　软骨的组织工程
软骨组织是组织工程学研究最多的组织。软骨只含有一种细胞-软骨细胞，它易于分离、生存和培养。 Green（1977年）曾将分离的软骨细胞移植于去钙的骨骼支架中，以复制软骨，未能成功〔3〕。提示人们有必要研制一种细胞传送装置，才能使移植细胞 得以成活和繁殖。Vacanti〔4〕（1988年）应用生物相容性好、并有生物降解性能的合成材料作为细胞外基质，结合细胞分离和组织培养技术，终于在 裸鼠的皮下组织中，形成了新的软骨组织。Vacanti〔5〕（1991）将牛的肩关节软骨细胞接种在非编织的可降解缝线上，植入裸鼠体内，形成了新的透 明软骨。1992年Vacanti等曾将软骨细胞接种到一些特定形态的聚合物支架上并植入体内，结果形成了与聚合物支架大小和形态相似的软骨。兔软骨细胞 －生物降解聚合物的体外培养、移植于裸鼠皮下的软骨形成及修复异种兔骨关节面软骨缺损，被Vacanti，Freed〔6，7〕(1994)等人的实验证 明是可行的。Vacanti（1994）在裸鼠体内成功地形成了衬有纤毛柱状上皮的管状软骨复合组织，并进行了气管替代动物实验研究。 Paige(1995)将含钙藻酸盐水凝胶与软骨细胞混合后注射到裸鼠皮下组织中，形成了新的软骨组织。我国学者曹谊林 〔8〕(1997)在人3岁外耳形状的支架材料上接种软骨细胞，经体外培养后植入裸鼠背部皮下，成功地再造了有精细三维结构人耳廓外形的软骨，获全美整形 外科协会颁发的最高荣誉—James Barrett Brown奖。刘彦春（1999）等将以卵磷脂、多聚赖氨酸及聚乳酸共同修饰的聚羟基乙酸支架与软骨细胞体外培养，并将细胞支架复合物回植到有免疫力的动 物兔体内，观察软骨的生成，并进行组织学及超微结构评价。结果基质产生旺盛，体内回植后软骨生成良好，实验表明，在有免疫力的动物体内可生成组织工程化软 骨。最近，德国慕尼黑大学头颈外科医院也在体外成功地构建人耳软骨和鼻软骨。软骨细胞培养，作为组织工程第一种获得成功的组织，给未来组织和器官的重建带 来了令人向往的前景。

　　3　骨的组织工程

　　将骨细胞移植于同种异体赋形材料上以产生新骨组织已被成功地应用。Kazuhito等（1993）将软骨细胞种植于羟基磷灰石人工骨上培养，然 后植入体内桥接骨缺损获得成功。Begley等（1993）的研究表明，松质骨组织来源的成骨细胞，也能在多孔的羟基磷灰石人工骨块上培养成活。成骨细胞 －生物降解聚合物的体外培养并移植于裸鼠体内皮下的成骨作用，以及移植修复裸鼠颅骨缺损，在1994年已有报道。Vacanti等将小牛骨膜细胞种植于多 层编织的PGA支架中，然后移植于裸鼠体内，结果证实骨细胞可以增殖而成为骨组织；观察其成骨过程，在最初几星期中，先出现软骨，最后才成熟而形成新骨， 这就是软骨化成骨过程。另一实验是将软骨细胞和骨膜细胞合并移植，将两种细胞分别种植于载体中，然后缝合在一起，埋植于动物体内；随着时间推移，证明种植 成骨细胞者只形成骨组织，而种植软骨细胞者仅能产生软骨，两者之间出现截然分界的骨-软骨接合面。
骨的组织工程学要求被种植的种子细胞必须是 有成骨潜能的细胞。目前已分别有研究利用骨外膜成骨细胞、松质骨组织来源的成骨细胞、软骨细胞及骨髓基质细胞作为骨组织工程学的种子细胞。其中，骨髓基质 细胞具有取材方便、对供体部位损伤小等优点，临床应用前景更广阔。郭昭庆等〔9〕（1999）将骨髓基质细胞种植于多孔状的羟基磷灰石块上，能在体外培养 成活，将这种细胞与载体的复合物异位植入体内后，部分表面能直接成骨，而且是板层骨，新形成的骨表面仍可见活性的成骨细胞，未见软骨形成。陈富林等 〔10〕观察了基因重组人骨形成蛋白-2对培养骨髓细胞生物学活性的影响。结果:低浓度的rhBMP2(<0.16 mg/L)对培养骨髓细胞的碱性磷酸酶活性、蛋白质含量均有明显的促进作用,且呈剂量依赖性；高浓度的rhBMP2(>0.16 mg/L)对培养骨髓细胞的增殖也有一定促进作用。余希杰等〔11〕认为：构建组织工程化人工骨应以成骨细胞为中心，在组成成份上包括破骨细胞、血管内皮 细胞及类似人体骨骼的有机、无机成份，为成骨细胞提供正常的细胞社会学环境，并含有最佳组合的生长因子缓释系统，促进成骨细胞快速增殖，发挥最佳成骨能 力，使植入体内的人工骨能快速血管化，与自体骨自然愈合，早日发挥生理功能。

　　4　带血管蒂的骨组织工程

　　这是将成骨细胞种植于预制带血管蒂的生物支架材料上，将它作为一种细胞传送装置。实验是用新生胎牛的骨膜细胞种植于聚合物支架上，在动物体内培 养2周后，再移植于小白鼠的右股动脉部位。6周时见有软骨细胞形成，包围于骨化小岛四周。最后在12个标本中，有10个显示新骨形成；骨化程度及骨形成密 度均随时间推移、血管长入而增加；最终在血管蒂旁形成了有骨小梁的新生骨骼组织，随后进行的带蒂骨组织移植修复骨缺损的效果良好。

　　5　腱组织工程

　　由于组织工程技术的进步，目前，关于组织工程化肌腱的研究得到很大的发展，主要包括三方面的内容：肌腱细胞外基质替代物的研究、肌腱细胞生物学 性质的研究和肌腱细胞与细胞外基质复合的研究。PGA与PLA共聚物，可得到机械性能好，柔韧性好，降解速度可改变的聚合物支架。但存在亲水性差和对细胞 吸附力弱等问题。人们在寻找理想的物质来包埋PLGA，增加其亲水性和增强对细胞的吸附力。对材料表面进行分子生物学设计，将一些有生理功能的物质如蛋白 质、多肽、酶和细胞生长因子等固定在材料表面，充当邻近细胞、基质或可溶性因子的配基或受体，使表面形成一个能与细胞相适应的过渡层。有实验表明，Fn作 为细胞外基质的一种成分，可明显地影响鼠肌腱细胞的活性。在天然的肌腱细胞外基质研究方面，王维民等用动物的肌腱，经组织工程学方法处理，脱去肌腱细胞， 获得了天然的胶原支架，这种支架的抗原性大为降低。肌腱组织的免疫原性是由肌腱细胞成分来表达的。通常采用冷冻、冻干及化学处理等方法破坏肌腱中细胞成 分，从而降低其抗原性。在促进肌腱细胞分裂增殖研究方面，蔚凡等已成功地建立了人胚肌腱细胞系，并建立了一套肌腱细胞分离、纯化、培养及冻存复苏的方法。 肌腱细胞的永生化，是肌腱细胞获得持续生长增殖能力的特性。对腱细胞的永生化不仅在于在排除或控制其致肿瘤的可能性后用于构建人工活性肌腱，更重要的是在 于利用它保存了细胞的功能特性和容易长期大量繁殖的特性，为研究肌腱细胞的免疫学和体外构建模式等方面提供容易繁殖的标准细胞株。华西医科大学已经用温度 敏感型SV40大T抗原质粒ptsA58H导入肌腱细胞株，成功地为肌腱细胞标准细胞株建立了转化模型〔12〕。目前，对肌腱细胞永生化还需进行深入研 究。一些学者的研究表明，在静态培养条件下，肌腱细胞与碳纤维编织带进行联合培养，腱细胞在编织带表面生长，分泌胶原取决于碳纤维的取向排列；而在体内植 入实验中，腱细胞能脱离碳纤维，在其间生长、分泌胶原；腱细胞和分泌的胶原有明显的取向性，沿碳纤维平行排列。实际上体内植入后腱细胞处在动态环境中，这 种动态环境提供了一个张应力环境，进而使腱细胞在此环境下生长、分泌胶原。曹谊林、Vacanti等从小牛肩、膝部的肌腱获得游离的肌腱细胞，植入索条状 未编织的PGA网状支架上；细胞密度为1.5×106/ml，在37 ℃，φ(CO2)25%的条件下培养1周；然后植入小鼠的皮下组织中。结果在6周的标本中，在支架四周均显示排列着拉长的肌腱细胞，埋植于胶原纤维中。在 12周标本中，从四周和中心部分已完全和正常肌腱细胞相同〔13，14〕。

　　6　皮肤组织工程

　　皮肤角朊细胞体外培养时对培养环境要求较高，且长期传代培养困难。为研究需要，国外一些学者曾采用多种病毒基因转化细胞的方法，获得了可长期传 代培养的角朊细胞系。在转化过程中，由于外源性基因整合至宿主细胞染色体的位点的不同，在所获得的角朊细胞系中有些致瘤性极低或无致瘤性，在创面修复研究 中具有重要价值。苏映军等〔15〕采用SV40病毒体外转化细胞的方法，获得了可长期培养的角朊细胞，经过筛选，得到了长期培养后对裸鼠无致瘤性的细胞 系，并对其体外生长的特性进行了观察。
Bell等〔16〕(1981，1983)先后将新生儿包皮细胞和真皮的成纤维细胞与牛Ⅰ型胶原制成载 体材料，上面附以人体表皮细胞制成人工皮肤，并证明可为人体创面所接受。皮肤缺损也可以用组织工程方法进行修复。如从烧伤患者身上取一小块皮肤进行表皮细 胞培养，在培养液中加入适当浓度的表皮生长因子，可以在短期内获得大量细胞，将细胞接种到PGA膜上，然后覆盖并修复皮肤缺损。对于涉及皮肤各层的严重创 伤，可以先接种成纤维细胞，然后在成纤维细胞表面接种表皮细胞，从而使皮肤获得有效的修复。临床试验表明，这种方法明显优于同种异体皮肤移植和皮肤代用品 移植。Yannas等〔17〕则应用一种可以防止体液丧失的硅胶膜，在其底层加上由硫酸软骨素和胶原合成的材料作为一种人工皮肤移植于烧伤创面，它可以诱 导血管长入和向内方产生新的结缔组织；3周后再在其表面移植一层菲薄的表皮皮片；经临床应用证明可以得到较好疗效〔17〕。Green等〔18〕的实验是 将表皮细胞先在体外做培养，cm2的表皮组织可以增加到10 000倍(等于一个成年人的体表面积)。方法是将角质层细胞在一层可供给营养物质的、经放射处理的NIH/3T3成纤维细胞上进行培养，可以得到细胞的快 速增殖。这种方法可望用来治疗大面积烧伤创面，但它的缺点是这种培养方法约需3～4周时间。我国第三军医大学王旭等 〔20〕应用新鲜尸体皮肤制成大片的真皮组织，制成固体胶原膜，并在其两面分别种植表皮细胞和成纤维细胞，培养后移植于烧伤创面，他们在10名患者中试 用，成活7例，随访1年，获得满意疗效。人工真皮dermgraft是第一代组织工程皮肤。它主要由可降解支架材料复合生长因子，接种胎儿皮肤成纤维细 胞，通过体外构建而成。经美国FDA认证，于1997年获准上市，并用于临床，作为大面积烧伤患者的暂时性皮肤覆盖（Allen,1994）及慢性皮肤溃 疡的治疗（Black,1994）。1998年创利6000万美金。然而Dermgraft与真正意义上的组织工程皮肤还有很大差距，它缺乏表皮层。 Apligraf是当前第二代组织工程皮肤产品，已实现产业化。它是在Dermgraft的基础上加入了表皮细胞层，使组织工程皮肤的组织学特性更加完 备。它已有与人的皮肤相似的复层结构。然而Apligraf仍然缺少许多正常皮肤组织的结构，如汗腺、毛囊和皮脂腺等，这些都是正在研究的热点问题。

　　7　胰腺组织工程

　　胰腺功能消退或丧失迄今仍没有重建和再生的方法。应用组织工程技术给胰腺的康复带来了希望。胰岛细胞的破坏会发生糖尿病，组织工程学的治疗方法 是通过移植包裹在胶囊里的胰岛细胞，以避免免疫排斥反应来完成的。包囊的膜具有对50×103大小分子的通透性限制，允许葡萄糖和胰岛素的自由扩散，但阻 止抗体和淋巴细胞的进出。实验证实，用这种方法治疗患糖尿病大鼠，可以保持正常血糖水平2年以上〔21〕。有3种实验方法〔22〕：①Sullivan等 先将可降解聚合物制成管状物，绕成螺旋状，再将胰岛细胞种植包埋于其内；将此管和另一个聚合物结合，然后移植入体内，再接连一个连接血管的装置。这种管有 50 000原子块状切割，可以允许葡萄糖和胰岛素进行渗透作用，但可阻止抗体和淋巴细胞进入。他在一只切除胰腺的实验犬中使用此装置，可维持正常血糖浓度达 150 d之久。②将含有小白鼠胰岛细胞的中空纤维固定于多糖藻酸盐中，将此装置放入患鼠的腹腔中，可降低血糖，并延续60 d以上，证明有良好的生物相容性。③将动物的胰岛细胞放入用藻酸盐或多晶体制成的微小包囊中，可在动物体内维持正常血糖达2年以上。以上3种方法主要的困 难是必须有大量的胰岛细胞来源。一些学者已使用了猪胰岛细胞进行研究。