猕猴耳廓软骨细胞体外不同的培养方式与生长活性

　　[摘要]目的：探讨猕猴耳廓软骨细胞在体外不同介质的培养情况及其生长活性。材料与方法：对6只猕猴进行耳廓软骨取材、软骨细胞的分离，并行单 层贴壁培养及在人工基质上的培养。通过倒置显微境和扫描电镜观察不同方式培养的细胞生长情况。结果：单层贴壁培养的软骨细胞可传代5～6代，但第三代软骨 细胞分泌的Ⅰ型与Ⅱ型胶原的能力无明显差别；在几丁质上培养的软骨细胞能保持体内细胞的正常形态；在VICRYL上培养的软骨细胞能分泌软骨基质。结论： 不同的体外培养方式下软骨细胞的生长活性略有不同，需根据不同的实验要求选择相应的培养方式。
[关键词]猕猴；　耳廓软骨；　细胞培养；　人工基质

　　细胞生存环境不同所表现的生物学特性有所差别。而软骨细胞的培养是组织工程化软骨最基础的步骤。不同的培养方式获得的软骨细胞经移植后形成的软 骨成分有差异［1］。因此有必要对体外培养的软骨细胞进行不同培养方式的研究。本实验对猕猴耳廓软骨细胞进行了单层培养和在立体人工基质上培养的研究，探 讨猕猴耳廓软骨细胞在体外不同介质的培养情况及其生长活性。

　　材料与方法

　　一、实验动物
猕猴6只，5～8岁(青年猕猴)，雄性，体重6～8kg。由上海西普尔动物实验中心提供。
二、方法
1. 软骨细胞悬液的制备
无菌条件下通过背侧进路获取猕猴一侧的耳甲软骨。将取下的耳甲软骨表面的软骨膜剥离，剪成2mm×2mm大小碎片，磷酸盐缓冲液(PBS，含青、链霉素 各100u/ml)冲洗3遍，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶(Sigma,USA)，置于37℃恒温振荡器(精华THZ-95型，江苏)内消化1h； 取出标本，弃去胰蛋白酶液体，加入含血清的培养液中止胰蛋白酶消化；然后再加入3倍体积的0.1%Ⅱ型胶原酶(Sigma,USA)，再置于37℃恒温摇 床内消化8～12h。见大部分软骨块被消化后，以200目尼龙网筛过滤，收集消化液，1000r/min离心5min使细胞沉淀。沉淀细胞以PBS洗3 次，以洗去细胞表面的消化酶。加入Ham'F-12培养液制成细胞液(Gibco,Gland Island,USA)，含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺300μg/ml,维生素C 50μg/ml,青、链霉素各100u/ml。台盼蓝染色计数。
2. 软骨细胞的培养与观察
(1)单层贴壁培养：将记数后的细胞移入25ml培养瓶中，每瓶接种细胞约5×105个，加入Ham'F-12培养液中，置于37℃、饱和湿度、 5%CO2细胞孵箱(Forma Scientific,USA)内培养，每2天换液1次，倒置显微镜(Olympus)下观察并照相，细胞长满后用0.25%胰蛋白酶传代。
将生长良好的第三代软骨细胞接种于玻璃片上，长满后取出，PBS冲洗，95%酒精固定：苏木精-伊红(HE)染色；ABC法进行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色(Ⅰ、Ⅱ型胶原鼠抗人抗体，Neomarker,USA)。
(2)加入人工基质培养：将消毒完毕的几丁质(直径15μm纤细，间隔150～200μm，厚度100μm，无纺网，由东华大学提供)和 VICRYL(Polyglactin 910)可吸收膜(Ethicon,USA)剪成5mm×10mm大小，置入96孔培养板。每孔加入5×106细胞悬液200μl，37℃孵箱内放置4h 后，每孔加入Ham'F-12培养液1ml,再置入37℃孵箱内培养。培养液每3d更换1次，倒置显微镜下观察并照相。
将VICRYL上培养1周的细胞立即用3%戊二醛固定，1%锇酸后固定，0.1M PBS冲洗后，乙醇梯度浓度逐级脱水，醋酸异戊酯置换，液体CO2临界点干燥，真空离子镀膜，JEOL-840扫描电镜观察。
结　果
单层贴壁培养的软骨细胞于接种后12h开始贴壁，24～36h完成贴壁变形。其外形为多边形，胞浆丰富，胞核清晰，有1～2个核仁，细胞长成一片可呈明 显的铺路石状外观。经过本方法消化发现培养后仅见单一的软骨细胞生长。细胞传至6～7代后，体积开始变大，出现指状突起，核变大，核仁增多，增殖速度减 慢。HE染色见胞核呈蓝紫色，胞浆淡红色(图1)。Ⅰ、Ⅱ胶原免疫组化染色见软骨细胞胞浆染成棕黄色，胞核不着色，Ⅰ、Ⅱ型胶原染色灰度无明显差异。

　　几丁质上培养的细胞在倒置显微镜下成球形或类球状，粘附于网状的纤维上，呈“树上结果”样(图2)。
VICRYL膜上培养的细胞在倒置显微镜下呈现类似贴壁状，但具扁平的立体形态。电镜观察发现培养1周后的软骨细胞在呈编织状的VICRYL(图3)上粘附生长，呈多边形，分泌的基质呈伪足样缠绕在VICRYL支架表面。

　　图1　培养软骨细胞HE染色(×40)(略) 　　图2　几丁质上培养的软骨细胞(略) 　　图3　VICRYL 膜上培养的软骨细胞(SEM，×100)(略)

　　讨　论

　　正常组织细胞的增殖是有限的。单层培养的软骨细胞只能传5代，因为传代过程会造成细胞的反分化［2，3］。我们观察到软骨细胞传至6～7代后呈 现明显增殖缓慢及衰老现象。软骨细胞在体内分泌多种胶原。其中Ⅱ型胶原的含量最高。研究表明单层贴壁培养的细胞在培养后5～6d即可发生反分化。即使在高 密度培养下，当软骨细胞传至第3代时，细胞亦出现反分化，其分泌Ⅱ型胶原的能力下降［4］。本实验发现体外培养的软骨细胞具备分泌胶原的能力，但其Ⅰ、Ⅱ 型胶原染色无显著性差异，证实了在单层培养中，软骨细胞形成软骨基质的能力逐渐下降，这也是细胞反分化的结果。但对单层培养而去分化的软骨细胞，应用低熔 点的琼脂糖进行培养，可促使细胞从合成Ⅰ型胶原转变为合成Ⅱ型胶原，即软骨细胞出现再分化的现象［5］。
传统的细胞培养方法和培养系统，很难 满足立体组织器官的细胞生长所需的高标准环境需求，因此出现了在三维结构支架上的立体细胞培养，并证实这种培养方法能明显促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原基质。 我们尝试了在几丁质上进行细胞培养。几丁质是一种疏松的无纺网结构，软骨细胞在其上生长呈圆形或类圆形，明显区别于贴壁培养的细胞形态，而与体内正常细胞 形态接近。可降解人工生物材料VICRYL是聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)的聚合物，在其上的细胞培养也证实了软骨细胞能为PGLA支架粘附， 并在其上生长，分泌软骨基质。
然而天然机体细胞都是处于机体提供的动力环境中生长的，组织工程的细胞培养需要模拟体内组织生长所处的微环境动 力学特征，既做到立体细胞培养，维持细胞正常形态和功能表达，又能通过动态流体环境，使营养成分均匀扩散进入整个细胞支架三维共聚体中，使细胞能获得生长 所必须的充分营养成分。根据这些设想和要求，研究者已构建了多种提供动力微环境的培养系统。如，模拟微重力旋转生物反应器(Simulated Microgravity in Rotating Bioreactors)系统、固体转动生物反应器(Solid Body Rotation in Rotating Bioreactors)系统、搅动混合旋转培养瓶(Turbulent Mixing in Spinner Flasks)系统、环绕混合培养皿(Orbital Mixing in Petri Dishes)系统。Gooch KJ等［6］研究了在搅动混合旋转培养瓶系统中不同的混合强度对软骨细胞的生长效应，结果在该系统培养形成的软骨含有较多的胶原成分。Sittinger M等［7］发明的灌注培养系统能恒定提供细胞所需的各种养分，在长期培养过程中能保持培养基pH值和葡萄糖浓度的稳定，用于三维生物材料聚合物-细胞的培 养试验显示出较好的效果，能为组织工程器官组织提供可靠的培养环境。此外，通过模拟机体环境中软骨细胞所处的动态负载环境，给体外的三维培养体系加以动态 的负载，如间断性加压负载，可促进体外软骨细胞的细胞基质合成［8］。
综上所述，不同培养方式的软骨细胞表现出不同的生长活性，单层培养的细胞易出现去分化现象，难以满足组织工程技术的需要，而解决细胞出现反分化的现象可能需要更先进的体外培养方式。

　　参考文献

　　1.Wakitani S,Kimura T,Hirooka A,et al.Repair of rabbit articular surfaces with allograft chondrocytes embedded in collagen gel［J］.J Bone Joint Surg,1989,71∶74
2.Freed LE,Grande Da,Lingbin Z,et al.Joint resurfacing using allograft chondrocytes and synthetic biodegradable polymer scaffolds［J］.J Biomed Mater Res,1994,28∶891
3.Puelacher WC,Kin WS,Vacanti JP,et al.Tissue-engineered growth of cartilage:the effect of varying the concentration of chondrocytes seeded onto synthetic polymer matrice［J］.Int J Oral Maxillofac Surg,1994,23∶49
4.Binette F,McQuaid DP,Haudenschild DR,et al.Expression of a stable articular cartilage phenotype without evidence of hypertrophy by adult human articular chondrocytes in vitro［J］.J Orthop Res,1998,16∶207
5.Benya PD,Shaffer JD.Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agrarose gels［J］.Cell,1982,30∶215
6.Gooch KJ,Frangos JA.Shear sensitivity in animal cell culture［J］.Curr Opin Biotechnol,1993,4∶193
7.Freed LE,Vunjak-Novakovic G,Langer R.Cultivation of cell-polymer cartilage implants in bioreactors［J］.J Cell Biochem,1993,51∶257
8.Freed LE,Vunjak-Novakovic G.Microgravity tissue engineering［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim,1997,33∶381