重组人骨形成蛋白-2、胶原、珊瑚复合人工骨异位诱导成骨的实验研究

　　【摘要】　目的　采用珊瑚作为载体，胶原作为缓释系统，制备出重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)胶原/珊瑚复合人工骨，并评价其骨诱导活 性。方法　rhBMP-2、胶原和珊瑚以一定的方式复合后，植入小鼠股部肌袋内，以单纯珊瑚植入作对照，术后不同时间取材，通过组织学方法检测骨诱导活 性。结果　复合人工骨植入1周诱导软骨形成，2周形成编织骨，4周形成含骨髓的板层骨，同时珊瑚被部分降解吸收。结论　胶原、珊瑚是rhBMP-2较理想 的载体，有缓释BMP的作用，该复合骨具有良好的异位诱骨活性，是一种比较理想的新型生物性植骨材料。
【关键词】　重组人骨形成蛋白-2　　胶原　　珊瑚　　诱导活性

　　临床现在主要采用自体骨、异体骨或人工生物材料植入等方法来修复、治疗骨缺损，但这些方法均存在着各种不同的缺点，使其应用受到不同程度的限 制。近年来有关各种成骨因子骨移植的基础与临床研究进展迅速，尤其是国内外相继成功地利用基因工程技术在真核和原核细胞中获取了高效表达人基因重组骨形成 蛋白-2(rhBMP-2)，为骨缺损的修复开拓了新的治疗途径。本实验将rhBMP-2与胶原、珊瑚复合制备出rhBMP-2/胶原/珊瑚复合人工骨， 并对其骨诱导活性进行了实验研究。

　　材料和方法

　　1.材料：人基因重组骨形成蛋白-2(rhBMP-2)由北京军事医学科学院提供；珊瑚：海南滨珊瑚；I型胶原：北京革瑞德生物制品有限公司。
2.方法
珊瑚的制备：以海南滨珊瑚为原料，制备成直径2mm球形颗粒，放入5%次氯酸钠溶液浸泡，流水冲洗，双蒸水超声清洗，烘干后，高压清毒备用。
rhBMP-2、胶原、珊瑚复合人工骨的制备：每个珊瑚颗粒与1mg rhBMP-2、0.1ml Ⅰ型胶原凝胶复合，真空抽干，术前用环氧乙烷(EO)消毒。
动物分级手术方法及样本处理：昆明小鼠4只，复合人工骨组3只，单纯珊瑚骨组1只。分别于左侧股部肌间隙内植入复合骨和珊瑚骨。分别于术后1周、2周各处死复合骨组小鼠1只，4周处死2只，取材，行组织学检查。

　　结果

　　标本肉眼观察：复合骨植入小鼠股部肌袋内1周时标本为纤维组织包裹，珊瑚无吸收，植入物表面可见半透明的软骨样结节。2周标本呈骨样组织，珊瑚有部分吸收。4周复合骨组标本呈骨块状，珊瑚骨组为纤维组织包裹的植入物，珊瑚有部分吸收。
组织学观察：所有切片都可见未被吸收的珊瑚因脱钙溶解所占据的空间，其中的纤维组织是长入孔洞内的。1周纤维结缔组织包绕在复合骨周围，并长入其孔洞 内，其中有大量未分化间充质细胞聚集和少量炎细胞浸润，并可见软骨细胞的分化和软骨基质形成。2周骨组织分化成熟，可见编织骨组织，呈多个片状，部分珊瑚 吸收。4周复合骨组可见大量的成熟骨组织，进一步占据珊瑚吸收后遗留的空间。珊瑚骨组，珊瑚部分吸收，软组织占位空间，未见软骨和骨组织。

　　讨论

　　关于rhBMP-2的应用：自Urist于1965年首次提出、1976年提取成功骨形成蛋白(BMP)以来［1，2］，到目前为止，对BMP 的提取、提纯、制备、应用及作用机制等方面的研究已取得很大进展。尽管从不同动物组织中提取的BMP具有高度的同源性，动物来源的BMP也能在体内诱导成 骨，但是若应用于临床，人BMP(hBMP)应是最理想的，而人新鲜骨质来源非常有限，难以满足提取hBMP的需要，因此，利用基因工程技术生产重组人骨 形成蛋白是BMP广泛应用于临床的关键。自1988年国外有学者运用基因工程手段，在真核细胞中克隆获得人基因重组骨形成蛋白1～4(rhBMP1～4) ［3］以后，陆续克隆获得了BMP家族中的其它因子。rhBMP-2被认为是BMP家族中骨诱导活性很高的生长因子，单独应用时可诱导软骨和骨形成。 1994年我国学者在大肠杆菌中表达成功，获得了高活性的rhBMP-2［4］。本实验采用的rhBMP-2是由军事医学科学院利用基因工程技术在大肠杆 菌中表达并经纯化的产物，结果表明它具有良好的骨诱导活性。

　　珊瑚人工骨的应用：自1971年人们发现海珊瑚具有与人骨相类似的孔隙结构后［5］，开始应用原始珊瑚碳酸钙作为植骨材料。20多年以来，经许多学者 的多种研究已知它具有良好的生物相容性及骨引导作用，并有生物降解性。其多孔结构有利于宿主骨组织和血液、纤维组织长入，但珊瑚在骨缺损区只具有支架和骨 引导作用，而无骨诱导能力。因此近年来有的学者将珊瑚与其它材料进行复合移植，以获得一种同时具备骨诱导活性和骨引导活性的新型材料。本实验将珊瑚与 rhBMP-2与胶原复合，将其植入小鼠肌袋内，结果表明，rhBMP-2/胶原/珊瑚复合骨具有较强的异位诱导成骨活性，珊瑚对rhBMP-2的生物学 活性未产生不利影响。
胶原的应用：胶原是一种由动物细胞合成的高分子蛋白质，广泛存在于哺乳动物的皮肤、骨骼、肌腱和韧带中。由于胶原有良好 的组织相容性，在体内可被吸收，已在临床应用多年。自BMP诱导成骨的理论成立后，有学者将胶原作为BMP的载体，用于修复骨缺损［6～9］。研究发现， 胶原作BMP的载体，一方面可防止复合材料的移动，还可防止BMP被过快吸收，具有缓释BMP的作用，延长了BMP的作用时间。采用珊瑚和Ⅰ型胶原作为 rhBMP-2的载体，植入小鼠肌袋内，证实胶原可延缓珊瑚在体内的降解速度，并不影响BMP的活性。
BMP与载体材料的复合方法：目前通常 将BMP溶于盐酸胍中，但采用这种方法不能准确掌握材料中复合的BMP量，并且有可能影响BMP的活性。利用胶原凝胶的粘性，将BMP包裹于珊瑚表面和微 孔中，能准确掌握rhBMP-2的复合量。另外胶原凝胶在与珊瑚的抽干过程中形成胶原膜，覆盖于粗糙的珊瑚微孔表面，有利于细胞的附着、组织的生长和新骨 组织的形成。
实验结果表明这种新型的复合材料具有良好的诱骨活性，可能成为理想的骨移植替代材料。

　　参考文献

　　1.Urist MR.Bone formation by autoinduction.Science,1965,150(4):893.
2.Urist MR.Mikulski A,Lietze A,et al.Solubilized and insolubilized bone morphogenetic protein.Proc Natl Acad Sci USA,1979,76(3):1828-1832.
3.Wozney JM,Rosen V,Celeste AJ,et al.Novel regulators of bone formation:molecular clones and activities.Science,1988,242:1528.
4.赵明，王会信，周廷冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性.生物化学杂志，1994，10(3)：319.
5.Weber JN,White EW,White RA.New porous biomaterials by replication of echinoderm skeletal microstructures.Nature,1971,233(1):337.
6.王大章，费伟，刘松筠，等.高生物诱导活性复合人工骨整复骨缺损的实验研究.华西口腔医学杂志，1997，15(1)：3.
7.Zellin G,Linde A,Importance of delivery systems for growth-stimulatory factors in combination with osteopromotive membranes.An experimental study using rhBMP-2 in rat mandibular defects.J Biomed Mater Res,1997,35(2):181-90.
8.马秦，毛天球，刘宝林，等.生物珊瑚、胶原和rhBMP-2合成人工骨修复兔下颌骨缺损的实验研究.实用口腔医学杂志，1998，14(1)：24-26.
9.胡晓波，夏筠，李群.诱导性人工骨膜的研制及实验研究.中华骨科杂志，1999，19(1)：50-53.