牙源性干细胞应用于牙髓牙本质再生研究进展

牙源性干细胞应用于牙髓牙本质再生研究进展

牙髓位于由牙本质围绕的牙髓腔中，借狭窄的根尖孔与根尖周组织相连，具有不断形成牙本质，为牙体组织提供营养、感觉以及免疫防御等功能。年轻恒牙由于龋病、牙齿发育异常或外伤等导致牙髓炎症或坏死。传统的治疗方法是根尖诱导成形术，经治疗后根管内为人工的材料，而不存在生活组织，牙髓免疫防疫能力丧失，牙齿使用质量和寿命也因此降低。如何让牙髓感染的患牙根管内牙髓再生，而不是用人工材料替代组织，是目前牙髓病学领域研究的重中之重。

    牙髓再生治疗（regenerative endodontic treatment，RET）为牙髓坏死的年轻恒牙仍提供了新的治疗选择，它是以生物学为基础、取代受损牙齿结构（包括牙本质、牙根和牙髓牙本质复合体）为目的的治疗技术。2012美国牙髓病学协会（AAE）根据牙髓血管再生治疗基础研究取得的成果，制定了牙髓血管再生治疗的临床操作指南。然而，动物实验研究发现RET后根管内壁和根管腔内形成牙骨质样、骨样组织和牙髓样组织，没有实现真正意义上的牙髓再生即形成牙髓牙本质复合体。

    随着组织工程技术的发展，以干细胞为基础的组织工程技术为牙髓病的治疗提供了新的方向和思路。组织工程技术旨在构建生物替代材料来修复受损组织，其包含3个要素，即干细胞、生长因子、支架。近年来在口腔组织中已分离出不同的干细胞，目前应用于牙髓牙本质再生的牙源性干细胞主要包括牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、根尖牙乳头干细胞（apical papilla stem cells，SCAP）和脱落乳牙干细胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth，SHED）。

    牙源性干细胞具有间充质干细胞的多向分化能力，在特定的微环境下，能向特定组织分化；来源丰富，阻生智齿、正畸拔除的前磨牙、脱落乳牙等医疗丢弃组织均为其重要来源，具有无医源性创伤，易于存储的优势。动物实验中应用牙源性干细胞结合生物支架材料进行异位或原位移植，均可实现牙髓牙本质样组织的再生，本文将对此方面的研究进展做一综述。

    1.牙髓干细胞

    2000年，Gronthos等通过酶消化法从人第三磨牙牙髓组织获得DPSCs，体外实验发现DPSCs与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymalstem cell，BMMSCs）具有相似的免疫表型，但DPSCs具有更高的集落形成率和增殖率，体外经矿化液诱导6周，形成分散而高密度的钙化小结。将DPSCs体外培养后与羟基磷灰石/磷酸三钙支架共培养后植入到免疫缺陷小鼠背部皮下，6周后能观察到牙髓牙本质复合体样的结构。

    有学者将DPSCs与低硬度3D纳米纤维明胶支架混合，外围包裹DPSCs与高硬度3D纳米纤维明胶，体外成骨诱导培养1周后，植入裸鼠皮下，4周后发现高硬度纳米纤维明胶能够诱导牙本质矿化形成，低硬度者能够诱导牙髓样组织、血管形成，实现牙髓牙本质复合体再生。研究结果提示调控纳米纤维明胶的硬度有助于牙髓牙本质复合体再生。

    目前在牙髓牙本质再生动物实验的研究中，常将细胞与支架如聚乳酸羟基乙酸共聚物、羟磷灰石/磷酸三钙、胶原等共培养植入裸鼠皮下，但这些支架材料多为外源性的，可能引起炎症反应，存在潜在的免疫原性和不完全降解性，从而可能影响组织再生。理想的支架既为细胞提供黏附和生长的空间，同时释放生长因子促进细胞的增殖分化。富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）是第二代血小板浓缩物，由Choukroun于2001年首次提出，因此亦称作Choukroun′s PRF。它是自体来源的富白细胞、血小板的纤维蛋白生物材料。

    PRF有如下优势：制备过程完全自然，不加使血小板激活及纤维聚合的抗凝剂和牛凝血酶/钙制剂；制备方法简单；包含大量生长因子，如转化生长因子-β1、血小板源性生长因子-AB、血管内皮生长因子等，并可持续、缓慢地释放生长因子至少持续1周。为探究PRF对DPSCs牙髓再生的研究，有报道将PRF/DPSCs膜片复合体结构置于牙根片段内，植入裸鼠背部皮下或将复合体结构直接放入犬牙根管内，术后8周观察到根管内有致密的新生血管形成，与正常牙髓样组织结构相似，并有新生牙本质样组织及成牙本质细胞样细胞分布于根管内壁，免疫组化显示成牙本质细胞样细胞牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）呈阳性表达。DSPP是牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）和牙本质磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）的复合体，是一种非胶原蛋白，被认为是主要的牙本质特异性蛋白。

    2.根尖牙乳头干细胞

    2006年，Sonoyama等从年轻恒牙根部发育中的牙乳头中分离出一种间充质干细胞，并命名为SCAP。SCAP是牙髓、牙本质的前体组织。体外研究表明，SCAP增殖能力、端粒酶活性及细胞迁移能力均强于来自成熟牙髓组织的DPSCs。将SCAP接种于羟磷灰石/磷酸三钙复合培养4 h，移植到裸鼠背部皮下，8周后组织学观察可见牙髓牙本质样结构形成。将SCAP和DPSCs 分别接种于聚乳酸羟基乙酸共聚物支架上，将复合物置于一端以矿物三氧化物凝聚体（MTA）封闭而一端敞开的长约6 ~ 7 mm的牙根片段内，植入裸鼠背部皮下，3个月后显示SCAP组有牙髓样组织及连续的牙本质样结构生成，DPSCs组形成的牙本质样结构较薄且不连续。同时也证明了仅有一端血液供应的空根管腔内可再生出含血管的牙髓牙本质样组织。

    有学者将三维无支架SCAP细胞聚合体与经过EDTA梯度处理的牙本质基质片段结合，并植入裸鼠皮下，6周后组织学显示牙本质壁表面有厚度一致且均匀的新生牙本质形成，且有一层均匀排列于新生牙本质表面极化的成牙本质细胞，管腔内可见牙髓样组织，免疫组化结果显示实验组成牙本质细胞对DSPP、骨涎蛋白、碱性磷酸酶和形成的牙髓牙本质对线粒体表达均为阳性。这说明新形成的成牙本质细胞仍然具有成牙本质的能力，而对人线粒体表达为阳性则说明复合体再生的牙髓牙本质复合体均为人来源的组织细胞。以上研究提示，SCAP是实现牙髓牙本质再生较理想的干细胞来源。

    3.脱落乳牙干细胞

    2003年，Miura等首次发现并报道了从人脱落乳牙牙髓中分离出具有多向分化潜能的间充质干细胞即SHED。其增殖率和群体倍增数均比BMMSCs、DPSCs高，其表达干细胞特征性的标志物STRO-1和CD146，同时可以向成牙本质细胞、脂肪细胞、神经细胞等分化。将SHED接种于聚乳酸羟基乙酸共聚物支架共培养30 min后，植入裸鼠皮下，2周后HE染色显示有牙髓样组织形成，免疫组化显示再生牙髓组织DSP 阳性，表明SHED能分化为成牙本质样细胞。

    为研究SHED在完整的根管内牙髓组织再生的潜能，有学者将SHED与可注射型支架人重组胶原蛋白-1或多肽水凝胶，共培养7 d后注射入根管内，然后植入裸鼠皮下，4周后组织学显示SHED与两种支架均能够在根管内形成牙髓牙本质组织，且伴有大量血管和纤维结缔组织。这提示SHED可作为牙髓再生的干细胞来源之一。但也有学者将SHED与磷酸钙类支架共培养植入裸鼠皮下，发现SHED能够诱导骨组织形成，而不是牙本质样组织。

    4.牙源性干细胞应用于牙髓牙本质再生的拓展

    传统的干细胞移植是将细胞制备成单细胞悬液，接种到相应的支架材料上，需要胰酶对细胞进行消化，在制备成单细胞悬液的过程中会导致细胞形态改变和表面蛋白的破坏，影响细胞活性；支架材料的细胞接种密度有限，细胞利用率低。细胞膜片技术是近年来发展较快的一项组织工程学技术，它主要通过刺激细胞外基质的合成使细胞紧密连结形成片状结构，由于其保存了大量细胞外基质、细胞间的黏附蛋白、细胞表面离子通道及生长因子受体等，有利于细胞发挥生物学特性，目前广泛应用于各种组织再生，包括角膜、心肌、肝脏、骨组织以及牙周组织再生。

    细胞膜片最初由日本学者Okano等发明的一种温敏性材料培养皿通过温度变化脱离而获得。有学者通过维生素C诱导牙源性干细胞形成细胞膜片，与传统的温敏性材料培养相比更易获得完整的细胞膜片。将DPSCs膜片置于牙根片段内，植入裸鼠背部皮下，术后8周观察到根管内有牙髓牙本质样结构形成。基于细胞膜片技术，有学者提出了三维立体细胞聚合体结构，将DPSCs与人脐静脉血管内皮细胞置于3D培养皿中培养成无支架的微小球体应用于牙髓再生，将微球置于牙根片段内植入免疫缺陷鼠背部皮下，4周后组织学显示与空根管相比可见血管和牙髓样组织再生。

    此外，DPSCs与人脐静脉血管内皮细胞联合培养有助于细胞外基质的沉积，为牙髓再生提供稳定的微环境。此外，干细胞来源的无细胞性外泌体在再生医学中的潜在应用成为目前组织再生领域的又一热点。外泌体是细胞经胞吐作用主动分泌的具有脂质双层膜结构的微小囊泡，直径40 ~ 100 nm，特异性表达CD9、CD81、CD63和Flotilin-1等标志物。人BMMSCs来源的外泌体已经被证实具有体外促进MSCs增殖能力和体内促进血管再生的作用。

    有研究显示，从人DPSCs中分离的外泌体能够促进成牙本质向分化所需的基因表达，在裸鼠背部皮下植入牙根片段，根管内同时加入DPSCs和含有外泌体的胶原膜，免疫组化染色发现根管内有牙髓样组织形成和新生的血管，在牙本质和软组织交界处牙本质基质蛋白-1和DSP表达显著增强，表明DPSCs来源的外泌体能够促进成牙本质向分化和修复性牙本质形成，后者也是功能性牙髓组织再生的关键。

    综上，牙髓再生在牙髓病学领域已引起广大学者的关注，并取得一定的进展，应用牙源性干细胞通过组织工程技术实现真正意义的牙髓再生具有广阔的发展前景。但如何使再生的牙髓牙本质复合体中不仅含有血管，而且还有来自根尖的神经纤维，尚需深入研究。