颞下颌关节紊乱病关节液中白细胞介素-1受体拮抗剂和白细胞介素-10的检测
[摘要]目的：探讨白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)和白细胞介素-10(IL-10)在颞下颌关节紊乱病(TMD)病因及发病机理中 的作用。方法：采用夹心法酶联免疫吸附测定法(Sandwich-ELISA)对31侧TMD患者及7侧健康志愿者的关节液进行了IL-1ra和IL- 10的检测。结果：健康志愿者的滑液中不能检测到IL-1ra的存在，TMD患者的关节液中IL-1ra的平均水平为 182.40±55.83pg/ml。TMD患者关节液的IL-1ra水平与健康志愿者滑液中IL-1ra水平之间的差异具有显著性(P＜0.01)。颞 下颌关节结构紊乱患者的IL-1ra水平为175.78±52.43pg/ml(n=14)；TMJ骨关节病(OA)患者的IL-1ra水平为 187.85±59.51pg/ml(n=17)；两者的差异不具有显著性。健康志愿者和TMD患者的滑液中均不能检测到IL-10的存在。结论：IL- 1ra和IL-10的缺乏或缺失在颞下颌关节紊乱病的病因及发病机理中可能起着重要作用。
[关键词]颞下颌关节 骨关节病 关节液 白细胞介素-1 受体拮抗剂白细胞介素-10
骨关节病(Osteoarthrosis,OA)是一个以关节软骨和软骨下骨成份降解与修复的正常平衡遭到破坏为主要特征的疾病过程［1］。在影响该疾病的诸多因素中，细胞因子的作用引起了诸多学者的重视［2］。
白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)是软骨细胞分解代谢的典型诱导剂，在软骨的吸收过程中起着重要作用［3］。白细胞介素-1受体 拮抗剂(Interleukin-1receptorantagonist,IL-1ra)是一种特异的受体拮抗剂，能够抑制IL-1α和IL-1β与 IL-1Ⅰ型及Ⅱ型受体的结合。尽管在氨基酸序列上IL-1ra与IL-1β有30%的同源性，与IL-1α有19%的同源性，但是它不具有内在的生物学 活性。许多体外培养及实验动物的疾病模型中表明，IL-1ra具有拮抗IL-1生物学效应的作用。所以，如果OA患者的关节中存在着IL-1ra，那么它 很可能抑制局部IL-1对软骨的破坏作用［4］。
白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)主要由单核细胞、T淋巴细 胞、B淋巴细胞和激活的角化细胞产生。它是单核细胞或巨噬细胞功能的强力抑制剂，能够抑制单核细胞产生肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-1、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-12以及粒-巨集落刺激因子(GM-CSF)。另外，IL-10能降低单核细胞Ⅱ型主要组织相容复合体(MHC)的表达，抑 制一氧化氮(NO)合成及前列腺素的产生。这表明，IL-10是一种重要的细胞因子抑制剂［5］。
本研究采用高敏感度、高特异性的夹心法酶联 免疫吸附测定技术(Sandwich-ELISA)首次对IL-1ra和IL-10是否存在于颞下颌关节骨关节病(TMJOA)滑液(SF)中进行了检 测，以探讨IL-lra和IL-10在TMJOA的病因及发病机理中所起的作用；也将为OA的预防及治疗提供一定的理论基础。
材料和方法
一、收集关节液：31侧颞下颌关节紊乱病SF取自北京医科大学口腔医院颞下颌关节病诊治中心进行关节造影及关节镜手术的27例患者，7侧对照组关节液取 自4名健康志愿者。疾病分类标准采用马绪臣、张震康所提出的分类方法［6］。诊断依据临床检查及X线检查结果(包括髁突经咽侧位片，许勒位片及关节造影检 查)。全部病例均行常规关节上腔穿刺，回抽无血后，注入2ml无菌生理盐水，连续注入、冲洗、回吸三次，获得关节冲洗液1.0ml～1.8ml，离心 (1000转/分，30分钟)后取上清，于-70℃冻存待测。
二、Sandwich-ELISA测定样品中IL-1ra和IL-10浓度：实 验操作严格按照QuantikineTM Human IL-1ra (IL-10) Immunoassay Kit (R&D Systems,Inc,Minneapolis,MN,U.S.A,Ca talog Number DRA00,D1000)操作程序进行：首先将标准品进行溶解并倍比稀释。然后将预备好的标准品、样品(共38侧关节的关节冲洗液，其中31侧为患者样 品，7侧为健康对照样品)用8道移液器移入预先包被有鼠抗人IL-1ra(IL-10)单克隆抗体的微孔板中，每孔200μl，每个标准品、样品设两个重 复孔：用不含标准品及样品的测定稀释液RD6G(RD6P)作为零对照(两个重复孔)。室温下静置2小时，洗涤4次。随后，加200μl的酶标抗体(偶联 辣根过氧化物酶的抗IL-1ra和IL-10多克隆抗体)，室温下静置2小时，洗涤4次。接着，再加200μl的底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺)，室 温下静置30分钟后加入50μl2N H2SO4终止反应，30分钟内用ELISA阅读计(Bio-Rad,Richmond,CA,U.S.A)测光密度(OD)值(测定波长450nm,参 考波长570nm)。试剂盒的最低检测浓度小于22pg/ml(2pg/ml)。
三、结果分析：①取各种标准品、样品、零对照重复孔的OD平 均值，然后将标准品、样品的OD平均值减去零对照平均值，得出各标准品、样品的OD值。②绘制标准曲线：以X轴表示浓度，Y轴表示OD值，将标准品的X值 及Y值描绘在图上，取其直线部分，求出回归方程。③将各样品的OD值代入回归方程，求出浓度值。④统计分析：除非另外说明，所有数值均采用均数±标准差的 表示方式；两组样本间比较采用学生组间比较t检验。
结果
一、临床资料：本研究的样品包括27例患者的31侧SF及4名健康志愿者 的7侧SF，计31例38侧关节SF。其中结构紊乱类12例(14侧)：包括可复性关节盘前移位8例(9侧)，年龄21～58岁，平均33.25岁；不可 复性关节盘前移位4例(5侧)，年龄17～45岁，平均26.25岁。X线片显示，所有结构紊乱类均无骨质改变。骨关节病类15例(17侧)：单纯关节盘 穿孔者2例(3侧)，年龄分别为59岁、21岁，无骨质破坏；有明确OA改变者13例(14侧)，年龄21～55岁，平均38岁，其中伴有关节盘穿孔者3 例(3侧)；伴有结构紊乱者10例(11侧)。4名健康志愿者无任何颞下颌关节病史，双侧关节无任何临床症状及体征，无风湿、类风湿及其他系统疾病史，关 系正常，面部发育基本对称。
二、IL-1ra和IL-10的浓度测量结果
滑液中IL-1ra水平：表1、表2及图1显示了IL- 1ra的平均水平和分布情况。健康志愿者的滑液中不能检测到IL-1ra的存在，TMD患者的关节液中IL-1ra的平均水平为 182.40±55.83pg/ml(表1和表2)。表1显示TMD患者关节液的IL-1ra水平与健康志愿者滑液中IL-1ra水平之间的差异具有显著 性(P＜0.01)。表2和图1示TMJ结构紊乱患者的IL-1ra水平为175.78±52.43pg/ml(n=14)，TMJ骨关节病患者的IL- 1ra水平为187.85±59.51pg/ml(n=17)；两者的差异不具有显著性(P＞0.05)。
滑液中IL-10水平：健康志愿者和TMD患者的滑液中均未能检测到IL-10的存在。
表1 TMD患者和健康志愿者滑液中IL-1ra的浓度
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n |
均数(pg/ml) |
标准差 |
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TMD* |
31 |
182.40 |
55.83 |
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健康志愿者 |
7 |
UD |
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*P＜0.01相对于健康志愿者；UD，未检测出
表2 TMJ ID和OA滑液中IL-1ra浓度
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n |
均数(pg/ml) |
标准差 |
|
TD |
14 |
175.78 |
52.43 |
|
OA* |
17 |
187.75 |
59.51 |
*P＞0.05相对于ID
讨论
本研究首次采用了高敏感度、高特异性的夹心法酶联免疫吸附测定技术对颞下颌关节紊乱病患者滑液中的IL-1ra和 IL-10表达情况进行了检测。结果表明，IL-1ra在颞下颌关节病患者滑液中有一定程度的表达，为182.40±55.83pg/ml；未能检测到 IL-10的存在。Malyak等曾经报道［4］，骨关节病患者大关节的11侧关节液中未能检测到IL-1ra的存在。这与本文检测结果不同，可能与我们 所使用的试剂盒的检测敏感度(22pg/ml)远较Malyak等人(500pg/ml)的为高有关。此外，颞下颌关节与大关节是否有所不同，尚不明确。
正常情况下，为诱导IL-1介导的反应，仅需要不足5%的IL-1受体激活即可。然而，在体内和体外，IL-1ra需高出IL-110倍-500倍才能 抑制IL-1活性的50%［7］。持续性炎症可导致包括IL-1在内的多种促炎细胞因子的上调，因而必须增加IL-1ra的量方能抑制炎症反应。已有报道 在体内IL-1ra需高出IL-1 100倍-10000倍时才能阻滞IL-1活性［8］。IL- 1ra若与滑膜上的IL-1受体结合，不仅需要和可溶形式的IL-1相竞争，而且需要和膜结合形式的IL-1α相竞争。由于膜结合形式的IL-1α比可溶 形式的IL-1更难降解，这就更加削弱了IL-1ra的抑制性活性［8，9］。因此，即使是我们检测出了一定水平的IL-1ra，结合Kubota等人所 测量的IL-1β的结果［10］，在TMJ OA和TMD滑液中，IL-1ra与IL-1β的比值分别为0.07和0.13，如果再加上未检测的IL-1α浓度值，这将远低于在体内需要完全阻滞 IL-1生物学活性的高达100-10000倍于IL-1的IL-1ra生物学剂量。
由于已有报道在TMJ OA滑液中存在着较高浓度的IL-1、IL-6和TNF-α［10～12］，这促使我们对TMJOA患者的IL-10(强力的抗炎细胞因子)水平进行了检 测，与本文相一致。健康志愿者和TMD患者的滑液中均未能检测到IL-10的存在。IL-10最初被认为是具有抑制Th1细胞功能的Th2细胞源细胞因 子。近来的研究表明，IL-10具有强大的免疫调节及抗炎效应［5，13，14］。另外，在体外培养中，它还能够阻止和逆转软骨的降解［15］。所以，对 于以软骨降解、同时伴随或继发于滑膜炎为主要特征的TMJ OA来说，有理由认为IL -10可以在TMJ OA的发病过程中起着拮抗作用。然而，本研究表明，在TMJ OA滑液中不能检测到IL-10的存在，这一结果与国外报道的大关节结果相一致［16］。为什么OA滑液中不能检测到IL-10?这可能与IL-10在 TMD滑液中的表达先天缺失有关。鉴于IL-10具有强大而广泛的免疫抑制效应，因此，IL-10先天缺失所致的促炎与抗炎细胞因子间的失衡继而引起的关 节软骨和软骨下骨成份降解与修复正常平衡的破坏很可能是TMJOA的发病因素之一。
总之，促炎细胞因子与免疫抑制或调节性细胞因子之间构成了 复杂的细胞因子网络系统，它们之间相互作用的失衡可能成为OA主要病因及发病机理之一，也是目前及未来OA的研究焦点之一。TMJ OA的发病过程中，高表达的促炎细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α导致关节软骨的降解，而微量表达的IL-1ra及不能检测到表达的IL-10等 免疫抑制或调节性细胞因子则不足以抑制软骨的降解并促进软骨的修复。IL-1ra及IL-10的缺乏或缺失可能是TMJ OA发病的重要因素之一。
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