Cell Host Microbe 浙大口腔丁佩惠等利用龈下细菌单细胞转录组分析揭示牙周炎中的细菌功能异质性与生态位特异性

Cell Host Microbe 浙大口腔丁佩惠等利用龈下细菌单细胞转录组分析揭示牙周炎中的细菌功能异质性与生态位特异性

牙周炎核心发病机制是龈下微生物群落失调。尽管过去数十年间，16S rRNA测序、宏基因组和宏转录组等技术已成功揭示了龈下微生物的多样性和群落水平的转录变化，但这些批量分析方法存在固有局限性：它们会平均不同类群或物种的信号，无法解析单个细菌细胞的功能异质性，也难以区分物种内不同亚群的特异性活动。此外，龈下样本具有微生物生物量低、宿主细胞污染严重等特点，给单细胞水平的研究带来巨大技术挑战。微生物单细胞RNA测序技术虽能精准解析个体细菌的功能差异，但现有实验流程对微生物输入量要求极高，且难以适配龈下样本的特性，限制了其在牙周炎研究中的应用。因此，开发一套适配龈下细菌的高保真单细胞测序方案，并借此解析健康与疾病状态下细菌的功能异质性，成为破解牙周炎发病机制的关键突破口。

为克服上述技术瓶颈，2026年2月，浙江大学良渚实验室研究员、博导，浙江大学医学院附属第一医院双聘研究员王永成、浙大医学院附属口腔医院主任医师、教授、博士生导师，丁佩惠团队合作于顶级期刊Cell&Host Microbe发表了题为“Single-cell profiling of the subgingival bacteria reveals transcriptional heterogeneity and niche-specific programs

研究团队首先优化了龈下细菌微生物单细胞RNA测序mscRNA-seq实验流程。通过一系列技术改良，包括采用4%多聚甲醛（PFA）即时固定以稳定RNA、梯度离心法高效去除宿主细胞和杂质、温和吹打替代涡旋避免细菌聚集等，显著提升了细菌回收率、纯度和完整性。优化后的数据显示，宿主污染率仅为2.69%，远低于此前宏基因组数据的33.35%，且约92%的细菌细胞保持完整膜结构，满足单细胞测序要求。同时，基于扩展的人类口腔微生物数据库（HOMD），团队构建了包含314万个非冗余基因的参考目录，功能注释率达74.42%，并通过保留rRNA的参考数据库提升物种注释准确性，genus水平与宏基因组数据的相关性在牙周炎样本中从0.41提升至0.70。最终，该方案成功对16个样本（8例健康对照、8例牙周炎患者）的133,458个细菌细胞进行测序分析，涵盖285个物种，其中57个核心活性物种被划分为8个功能集群，为后续功能解析奠定了坚实基础。



研究发现，健康与牙周炎状态下龈下细菌的功能组成存在显著差异。健康状态下，负责黏附与多糖降解的细菌亚群占据主导地位。其中，长奈瑟菌（N. elongata）作为黏附相关功能集群的优势物种，通过表达黏附因子、VI型分泌系统（T6SS）等维持口腔黏膜稳态，其T6SS还能抑制牙龈卟啉单胞菌的上皮入侵，发挥益生菌作用；劳特罗普菌（L. mirabilis）则主导多糖降解功能，其多个亚群分别负责不同聚糖降解、能量代谢和应激响应，产生的低聚糖可调节宿主免疫力，对维持口腔微生态平衡至关重要。而在牙周炎状态下，这些健康相关亚群的转录活性显著下降，长奈瑟菌的转录活跃细胞数量从4334个锐减至870个，劳特罗普菌则下降约9倍，其负责翻译和T6SS功能的亚群占比大幅降低。与此同时，转座酶阳性细胞和厌氧铁氧还蛋白利用细胞大量扩增，伴随有氧能量代谢基因（如丙酮酸脱氢酶复合物成分AceE、AceF）下调，发酵代谢基因（如乙醇脱氢酶AdhP、乳酸脱氢酶LdhA）上调，呈现典型的厌氧适应特征。



代谢层面的分析进一步揭示了牙周炎的发病机制。研究通过代谢组学检测发现，牙周炎患者龈沟液中多种氨基酸（如甘氨酸、色氨酸、瓜氨酸）含量显著升高，形成富含氨基酸的微环境，为致病菌的增殖提供了营养基础。关键致病菌在这种环境中呈现出物种特异性的氨基酸代谢转录程序：牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）上调蛋白酶和精氨酸分解代谢相关基因，通过质子依赖型转运系统摄取二肽和三肽，其精氨酸脱羧酶（SpeA）等基因的高表达可将精氨酸转化为腐胺，参与炎症反应和免疫逃逸；中间普雷沃氏菌（P. intermedia）存在一个在牙周炎中显著富集的特异性蛋白水解亚群，其蛋白酶活性显著高于其他亚群，成为主要的蛋白降解执行者；齿垢密螺旋体（T. denticola）则优先表达ABC型寡肽转运蛋白、精氨酸脱亚胺酶和甘氨酸还原酶相关基因，通过独特途径利用氨基酸产生能量，其组氨酸和色氨酸降解相关基因也在特定亚群中高表达，与组织破坏和口臭形成相关。这些致病菌的代谢协同作用，共同加剧了牙周组织的炎症损伤。

此外，研究还通过单细胞亚聚类和功能验证，深入解析了关键细菌的转录异质性。例如，牙龈卟啉单胞菌被划分为7个转录状态，其中氧化应激防御亚群在健康状态下更活跃，而蛋白水解和信号转导亚群在牙周炎中显著富集，厌氧条件可诱导信号转导基因和牙龈蛋白酶表达；长奈瑟菌的全基因组测序显示其基因组中存在成簇的黏附因子、菌毛和T6SS相关基因，扫描电镜证实其具有杆状形态和黏附口腔上皮细胞的能力，体外厌氧培养实验则验证了缺氧环境对其生长和功能基因表达的抑制作用。这些发现不仅阐明了细菌在健康与疾病状态下的功能转换机制，也为靶向治疗提供了具体靶点。

研究同时指出了自身局限性，如部分基因未被注释、样本处理可能引入物种特异性偏差、未能充分分析宿主-微生物相互作用、样本量有限等，未来需要更大规模的队列研究和更先进的技术手段加以完善。

综上，该研究首次建立了适配龈下细菌的高保真mscRNA-seq技术方案，构建了健康与牙周炎状态下龈下细菌的单细胞转录组图谱，揭示了“健康相关细菌亚群减少、致病菌氨基酸代谢程序激活”的核心病理特征，阐明了细菌功能异质性在牙周炎发病中的关键作用。这一成果不仅深化了对牙周炎发病机制的理解，更为开发靶向致病菌特异性代谢通路的精准治疗策略、寻找疾病早期诊断生物标志物提供了重要理论基础和实验依据，推动了牙周炎治疗从广谱抗菌向精准生态干预的范式转变。