综述 | 自噬在种植体周炎中的作用研究进展

综述 | 自噬在种植体周炎中的作用研究进展

作者姓名：王宇曦，宋应亮

基金项目：国家自然科学基金（81771107）

作者单位：口颌系统重建与再生全国重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔材料与先进制造工程技术研究中心，空军军医大学第三附属医院口腔种植科，陕西 西安 710032

通信作者：宋应亮，电子信箱；songyingliang@fmmu.edu.cn

摘要：种植体周炎是一种由菌斑微生物、创伤等因素引起的种植体周软硬组织炎症性病损，其特征为种植体周围的黏膜炎症，并伴有支持骨丧失，严重时可导致种植体松动或脱落。目前，种植体周炎已成为口腔种植手术后常见的生物学并发症，了解其发病机制对于该疾病的临床预防和治疗至关重要。自噬是一种高度保守的溶酶体降解程序，与骨免疫、微生物感染、组织炎症及再生等生物学过程密切相关。通过这一程序，细胞能够消化胞内蛋白及细胞器，从而实现自我更新或适应环境变化。不足或过度激活的自噬可能会导致血管内皮细胞、中性粒细胞、牙龈成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞、成骨细胞及破骨细胞的功能失调，且这些细胞在炎症状态下的生理学改变与种植体周炎的发生和发展密切相关，提示自噬在种植体周炎中可能发挥重要作用。文章从细胞学角度就自噬在种植体周炎的发生发展过程中的潜在作用做一综述，以期为预防和治疗种植体周炎提供潜在靶点及研究思路。

关键词：自噬；种植体周炎；炎症；巨噬细胞；中性粒细胞

自噬（autophagy）是一种通过胞内双层膜结构包裹受损或老化的细胞器或蛋白质，并将其运送至溶酶体进一步消化代谢的细胞自我更新过程［1］。起初，人们认为自噬是一种生理状态下的物质代谢方式，细胞可通过基础水平的自噬实现更新并避免死亡［2］。随后人们发现当细胞处于饥饿、氧化应激、病原体侵入及各种极端状态下时，自噬可作为一种保护和适应机制，通过分解代谢细胞内物质以生成多种底物来应对环境的改变［3］。

种植体周炎（peri-implantitis）是一种由菌斑微生物、创伤或骨灼伤等因素引起的不利于种植体周软硬组织结合的炎症性病损［4］；其中，菌斑是其始动因素［5］。菌斑感染种植体后的病理过程涉及多种细胞的参与：细菌侵入种植体周围可引发炎症反应，中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞募集至感染部位；炎症累及软组织时会影响内皮细胞、成纤维细胞及上皮细胞的生理功能，导致牙龈红肿、龈沟液生成减少及上皮屏障能力下降［6］；炎症进一步扩展至骨组织时，可造成巨噬细胞极化失调并向破骨细胞（osteoclast，OCs）分化，引起周围支撑骨不同程度吸收，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）归巢［7］。大量研究表明，自噬可调节上述细胞的生理功能［8］。同时，种植体周炎的发生和发展过程与牙周炎相似，二者均由菌斑介导的软组织炎症进展至支持骨丧失［9］。以往研究证实了自噬在牙周炎中的作用［10］，最近有研究显示了自噬与牙周炎及种植体周炎的联系。Ozkocer等［11］提取了牙周炎与种植体周炎的上皮组织和结缔组织进行比较发现，二者的炎症细胞密度值、坏死组织碎片密度值及结缔组织胶原密度值等均无显著差异；其还通过比较自噬标志物轻链3（light chain 3，LC3）及Beclin-1的表达，发现这2种病理状态下的自噬水平也无显著差异。上述研究结果是否提示自噬在种植体周炎中的作用与牙周炎类似还有待进一步证实。除菌斑微生物外，自噬也与一些导致种植体周炎的非细菌性危险因素相关，如吸烟、钛金属溶解等［12］。本文从细胞学角度出发，就自噬在种植体周围软硬组织炎症状态下的潜在作用做一综述，为深入探讨自噬在种植体周炎发生发展中的作用提供重要线索和研究思路。

1    自噬概述

1963年，Radewa首次提出自噬概念［13］。随着研究的不断进展，自噬现包括3种类型，即巨自噬（macro-autophagy）、微自噬（micro-autophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）［14］。其中，巨自噬是自噬的主要形式，与细胞生物学、生理学和病理学的联系较为密切，即通常所说的自噬。

目前已确定的自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）超过30种，其共同参与调控自噬过程［15］。该过程较为复杂，包括自噬泡的起始、延伸及成熟，自噬体（autophagosome）的形成，自噬体与溶酶体融合，以及自噬溶酶体（autolysosome）降解物质等多个阶段。自噬过程始于自噬泡的起始和延伸。自噬泡的起始阶段需先激活哺乳动物Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶VPS34，且需多种蛋白复合物（如Beclin-1、p63和ATG14）的共同参与。自噬泡的延伸过程受丝氨酸/苏氨酸激酶mTOR调控，mTOR可通过表观修饰使ATG13磷酸化来抑制自噬的发生［16］。自噬泡的成熟过程可通过2种泛素化偶联机制使自噬相关蛋白定位于双层膜结构中：①在ATG14的协助下，磷脂酰乙醇胺偶联到LC3-Ⅰ上成为LC3-Ⅱ，其可被荧光探针染色为点状荧光物质；②在ATG7和ATG10的协助下，ATG12共价偶联到ATG5上。至此，自噬泡成熟，形成包裹着胞内物质的双层膜囊泡结构——自噬体。随后，自噬体被运输至溶酶体并与之融合形成自噬溶酶体，在自噬溶酶体酶的作用下进一步消化代谢胞内物质［14］。生理状态下自噬处于较低水平，其可作为一种细胞代谢方式来调控正常的生理过程［2］。但有研究显示，某些病理状态下的自噬激活或不良可能与疾病的发生发展相关；因而，自噬被视为一种细胞应对炎症、应激及病原微生物侵入时的自我保护机制，细胞可通过自噬途径代谢分解胞内物质来应对胞外环境的改变［17］。

2    自噬在菌斑导致的种植体周围软组织炎症中的作用

菌斑导致的种植体周围组织炎症早期主要累及软组织，在影像学上无骨丧失［18］。随着软组织炎症的进一步加重，可逐渐累及支持骨，形成种植体周炎［4］。种植体与周围组织直接接触连接，缺乏类似牙周韧带及其内的微小血管等结构，因而，相较于天然牙，在细菌感染种植体的早期阶段免疫细胞外溢较差，对细菌的抵御作用较弱［19］；且细菌入侵后，种植体周围软组织形成的包绕种植体的环形结构（即“袖口”）可能被破坏，导致袖口松弛，封闭能力下降［20］。上述过程主要涉及中性粒细胞、血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）、人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）及牙龈上皮细胞（gingival epithelial cells，GECs）等。

2. 1   中性粒细胞    中性粒细胞被认为是种植体周围软组织炎症发生时的第一批定位细胞，其主要通过吞噬、脱颗粒、活性氧的产生和中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）的释放等途径防御病原体入侵［21］。现有研究强调了炎症状态下自噬与中性粒细胞生物学功能之间的密切联系［22］，即中性粒细胞通过上述途径清除病原体的能力依赖于自噬的激活。Bhattacharya等［23］观察到自噬缺陷小鼠体内的中性粒细胞脱颗粒作用有所减弱。Guo等［24］通过自噬诱导剂和抑制剂处理中性粒细胞，观察到NETs的释放与LC3蛋白表达趋势相关；并发现在体内应用海藻糖（一种不依赖mTOR的自噬诱导剂）可促进NETs的释放，应用雷帕霉素（一种依赖mTOR的自噬诱导剂）未促进NETs的释放，而应用自噬抑制剂（如3-甲基腺嘌呤、羟氯喹）则抑制NETs的释放。此外，中性粒细胞可通过自噬途径清除胞内病原体。被感染的中性粒细胞通过自噬介导的途径形成多泡体，并与含有细菌的吞噬体融合，从而启动吞噬杀伤过程［25］；同时，自噬也可直接检测和消除病原体（包括胞内细菌和病毒）［26］。总之，炎症状态下的自噬激活是中性粒细胞发挥生理功能的重要保证。
2. 2    ECs    生理状态下，ECs自噬对细胞内血小板内皮细胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM1）和血管内皮钙黏蛋白5（cadherin 5，CDH5）等连接蛋白的正常代谢十分重要，基础水平的自噬可维持ECs稳态［27］。当种植体周围处于难以逆转的炎症状态时，免疫细胞从牙龈ECs的相互连接中大量穿出，迁移至口内引起免疫反应［28］。Reglero-Real等［29］研究发现，ATG5敲除小鼠的ECs间连接扭曲且异常增厚，连接处PECAM1及CDH5累积，这种细胞间的异常连接结构可导致中性粒细胞跨内皮运输上调，增加炎症细胞浸润，最终造成组织损伤。Reglero-Real等［27］还发现，炎症组织中ECs自噬的激活改变了ECs间的连接结构和PECAM1的表达，其可下调中性粒细胞溢出，在一定程度上起到终止炎症的作用。上述研究表明，炎症状态下ECs的自噬激活是血管内皮维持局部稳态的关键途径，其自噬激活程度与炎症浸润程度相关。
2. 3    HGFs    HGFs是种植体周围软组织中的主要细胞，其可维持软组织的结构和功能，并在免疫防御过程中发挥积极且关键的作用［30］。感染种植体的细菌主要以革兰阴性菌为主，如牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）［31］。Liu等［32］研究发现，HGFs受到P.gingivalis脂多糖刺激时，可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路来激活自噬，以应对细菌感染。同时，细菌的刺激可诱导HGFs分泌多种炎症因子［33］。有研究发现，牙龈炎症可上调HGFs自噬，进而分泌更多的细胞因子［如白细胞介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）］；但过量的炎症细胞因子堆积会破坏胶原蛋白，损伤软组织的正常结构和功能［34］，这可能与炎症状态下自噬增强及线粒体结构破坏相关［35］。以上研究均表明，自噬与HGFs关系密切；软组织炎症发生时，适当激活的自噬可帮助HGFs抵御菌斑微生物侵袭，但过度激活或不受控制的自噬可能造成软组织损伤。
2. 4    GECs    种植体周围上皮组织封闭是抵御细菌入侵的第一道防线，而GECs是其中的主要细胞［36］。但部分研究认为，自噬可能是P.gingivalis藏匿于GECs，并发生免疫逃逸的重要机制。P.gingivalis作为一种机会感染菌，可长期存在于种植体周围，其数量在种植体周炎发生时显著增加，并与炎症进展程度呈正相关［37］。Liu等［38］研究发现，P.gingivalis可能通过促进GECs内的溶酶体外排，阻断自噬体与溶酶体融合来破坏自噬通量，并在体内长期存活。有研究应用透射电镜观察到，P.gingivalis感染GECs后可定位于富含双膜结构的自噬体空泡内质网内，而抑制自噬可显著降低P.gingivalis活力［39］。

3    自噬在菌斑导致的种植体周围硬组织炎症中的作用

软组织炎症逐渐累及硬组织可导致支持骨丧失，影像学表现为种植体周围透射影区。与仅局限于种植体周围软组织的炎症相比，种植体周围骨丧失时炎性细胞浸润增加［40］；该过程除涉及上述细胞外，还包括巨噬细胞、MSCs、OCs及成骨细胞（osteoblast，OBs）。

3. 1   巨噬细胞    巨噬细胞是具有功能可塑性的免疫细胞，其可在不同刺激下极化为M1型促炎表型和M2型抗炎表型［41］。巨噬细胞极化失调是种植体周炎发生发展的重要机制，且该过程与自噬相关。Liu等［42］敲除小鼠的自噬相关基因ATG5后发现，骨髓来源的巨噬细胞向M1型促炎表型极化增加，表明巨噬细胞的自噬受损会促进免疫激活。Galarraga-Vinueza等［43］通过免疫组织化学分析发现，发展至晚期的种植体周炎中M1型巨噬细胞增加，这可能与自噬介导的M1型巨噬细胞持续存在相关。Liu等［44］研究发现，泛素特异性蛋白酶19（ubiquitin specific peptidase 19，USP19）可通过增加自噬通量来抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性小体的激活，并可直接促进M1型巨噬细胞向M2型极化。此外，典型的M1型巨噬细胞可分泌多种炎症因子［如TNF-α、IL-6、IL-12、IL-1β、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2及MMP 9）等［45］］，其不断累积可导致种植体周围的慢性炎症。其中，TNF-α和IL-1家族细胞因子（如IL-1α、IL-1β）已被证实与自噬相关。Ge等［46］研究认为，IL-1α和IL-1β可驱动自噬过程，且自噬可反馈调节IL-1α和IL-1β的分泌和降解。但自噬对TNF-α的调节尚无统一定论。一项体外研究发现，在脂多糖处理的巨噬细胞中，自噬激活可下调TNF-α表达，减轻炎症反应［42］。Wang等［47］抑制巨噬细胞自噬或敲除LC3基因后发现，TNF-α的表达量未发生显著变化。此外，Xue等［48］发现，过表达Beclin-1可逆转IL-17A上调引起的小鼠巨噬细胞凋亡。
3. 2    MSCs    MSCs是一种具有多向分化潜力的细胞，其可通过成骨分化来达到治疗目的，常作为工具细胞用于种植体周围组织再生和修复中［49］。在机体内，其可通过较高水平的基础自噬来实现自我更新以保持干细胞活性［50］。但当炎症刺激导致骨稳态被破坏时，MSCs会迅速响应以启动骨再生过程［51］。有研究指出，α酮戊二酸可上调MSCs自噬，并诱导其成骨分化［52］。Li等［53］研究却发现，炎症过程中休克蛋白70（heatshockprotein70，HSP70）可通过自噬途径介导再生肝磷酸酶2（phosphatase of regenerating liver 2，PRL2）降解，从而减少骨细胞生成，加速骨吸收过程。此外，MSCs衍生的外泌体在治疗种植体周炎方面也表现出巨大的潜力。有研究显示，经脂多糖处理的MSCs来源的外泌体可通过增强线粒体自噬来抑制巨噬细胞干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）的信号传导，从而在细菌感染时起到组织保护作用，这一效应与ATG2相关［54］。
3. 3    OBs和OCs    骨的溶解、生成和重塑在生理条件下维持平衡，且OBs和OCs在该平衡中均发挥重要作用［55］。炎症状态下自噬可通过影响巨噬细胞向OCs转化来调节骨溶解。Hiura等［56］研究发现，下调自噬不仅可抑制小鼠巨噬细胞向OCs转化，还可抑制OCs肌动蛋白环的形成，从而降低骨溶解作用。另一项研究发现，自噬在体外诱导巨噬细胞破骨分化的过程中被激活，且Beclin-1蛋白表达增强，而敲除Beclin-1基因的小鼠OCs功能受损，提示自噬参与OCs分化［57］。此外，体外研究显示IL-17A可激活小鼠OBs的自噬，并上调铁蛋白的表达，促进成骨分化［58］，这提示炎症因子诱导的自噬激活在骨生成中的潜在作用。上述研究表明，炎症状态下自噬对骨稳态的调节并非单向作用，因而更需综合考虑其在不同炎症阶段对各种细胞的特异性影响。

4    自噬在非菌斑因素导致的种植体周围软硬组织炎症中的作用

除菌斑因素外，Kim等［59］发现自噬的激活可抑制香烟暴露下的HGFs凋亡，从而对细胞起保护作用。另外，有研究指出材料降解或钛颗粒释放所导致的自噬激活也是种植体周围骨溶解的潜在危险因素［60］。Chen等［61］研究发现，钛颗粒刺激下种植体周围产生的无菌性炎症可激活自噬过程，使OCs生成增加，进而导致骨溶解。这种无菌性炎症下的自噬激活所引起的骨溶解与有菌炎症状态下的自噬激活所发挥的骨保护作用不同，表明自噬对种植体周围骨稳态的调控是把双刃剑。
5    结语   
        自噬是一个有助于细胞响应环境变化进而调控生理功能的动态过程，其效应模式取决于特定疾病的发生发展水平。大量研究证实了自噬在炎性疾病、骨代谢及组织再生中的影响，并为以自噬为靶点的种植体周炎治疗提供研究方向。生理条件下，基础水平的自噬是一种细胞实现自我更新的方式，对维持种植体周围组织稳态至关重要。在种植体周炎发生发展过程中，自噬是一把双刃剑。一方面，其可作为一种保护和适应机制，通过溶酶体降解途径调控胞内物质代谢，从而使处于炎症、感染等不利环境下的种植体周围细胞执行正常的生理功能；在菌斑因素导致的种植体周炎中，自噬可通过清除胞内病原体及其产物，调节免疫细胞迁移及活力，增强MSCs成骨分化，以及调节OCs生成等作用来保护种植体周围软硬组织。另一方面，在某些条件下，受损或过度激活的自噬可能造成局部炎症加剧；同时病原微生物也可通过自噬途径藏匿于细胞内，从而发生免疫逃逸，对种植体周围软硬组织产生负面影响。以往研究对不同病理阶段如何调控自噬以实现治疗目标并无统一定论，且多为体外模型研究；应更集中于阐明不同炎症阶段自噬对种植体周围组织和细胞的特异性功能，这也将更有助于理解种植体周炎的发生发展过程。
参考文献  略