牙体玻璃离子充填材料边缘微渗漏的激光扫描共聚焦显微镜与金相显微镜比较研究

 　　牙体玻璃离子充填材料边缘微渗漏的激光扫描共聚焦显微镜与金相显微镜比较研究

  　　目的：在两种不同显微镜下定量观测人离体牙充填玻璃离子水门汀后边缘微渗漏的情况，并对两种方法进行比较。方法：选取新鲜无龋前磨牙，备洞，充填玻璃离子水门汀，37℃ 水浴条件下分别置于0．1％ 罗丹明B荧光染料或1％甲基蓝溶液浸染，激光扫描共聚焦显微镜和金相显微镜下分别测量染液渗入深度，定量评价微渗漏程度，对两种方法的检测结果进行比较。结果：两种方法均能检测到染液渗漏，在分别充填传统型玻璃离子水门汀和树脂改性玻璃离子水门汀的情况下，金相显微镜下测得的渗漏值分别为(33．18±5．59)I．zm和(32．30±3．76) m，与激光扫描共聚焦显微镜下所得渗漏深度(22．57±2．59) m及(21．93±1．51) m相比，差异有显著统计学意义 (P<0．05)。结论：激光扫描共聚焦显微镜和金相显微镜均可用于牙体充填材料边缘微渗漏的观测，但综合效果前者更优。

  　　关键词：牙体；玻璃离子水门汀；树脂改性玻璃离子水门汀；微渗漏；激光扫描共聚焦显微镜；金相显微镜

  　　中图分类号：R78；Q336 文献标识码：A

  　　牙体充填治疗后发生的微渗漏对临床治疗成败有重要影响。因此，许多研究者致力于微渗漏的检测，诸多的研究方法也应运而生。选择高效准确的方法或仪器对提高研究的精确性有很大意义。本实验采用激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM ) 和金相显微镜 (metallurgical microscope)测量玻璃离子水门汀充填离体牙的边缘微渗漏情况，通过对两种仪器所需标本制备及所得结果的比较研究，提出微渗漏优选检测手段。

  　　1 材料与方法

  　　1．1 材料与仪器

  　　新鲜拔除的人无龋前磨牙(拔除后机械去除牙石及牙周软组织，置于4℃ 生理盐水中储存备用)，罗丹明B(Rhodamine—B，美国Sigma公司)，甲基蓝 (上海化学试剂有限公司)，传统型玻璃离子水门汀和树脂改性玻璃离子水门汀(而至富士公司，GC Fuji II及GC Fuji II LC)，激光扫描共聚焦显微镜 (德国LEICA TCS SP2型)，金相显微镜(奥地利徕卡公司MeF3型)。

  　　1．2 方法

  　　4O颗人无龋坏前磨牙，咬牙合面备I类洞，洞深为釉牙本质界下2 mm，直径4 mm。随机分为 CLSM 观测组(A组)和金像显微镜观测组(B组)；每组又随机均分为2个亚组(A1、A2组和B1、B2 组)，分别充填传统型(A1和B1组)和树脂改性玻璃离子水门汀(A2和B2组)。
充填后待标本干燥2～3 h，距充填材料边界1 mm以外的部分均匀涂布两层指甲油，A组置于37 ℃水浴中，在0．1％罗丹明B荧光染液中浸泡24 h，蒸馏水冲洗10 s；B组则在1％ 甲基蓝溶液中染色 24 h，流水冲去表面浮色；两组均用金刚砂切片沿牙体长轴近远中向纵行切开。B组的检测面需依次在粗、细砂纸上打磨平整，冲洗。

  　　A组在100％ 相对湿度下用激光共聚焦检测，氩激光扫描，点面扫描2×4。激发波长546 nm，发射波长600 nm。测量并记录在激光共聚焦荧光模式下充填材料与牙体界面间荧光剂的渗漏深度作为其微渗漏值，图像使用LEICA TCS SP2分析软件测量；B组则置于金相显微镜下，用磨砂玻片过滤强人射光偶成像，所测量的染液浸入窝洞的深度为渗漏

  　　表1 A1，B1两组渗漏深度测量结果(μm)

  　　Table 1 M arginal microleakage depth of glass·ionomer cements measured by two methods(μm)

  　　表1 A1，B1两组渗漏深度测量结果(μm)

  　　Table 1 M arginal microleakage depth of glass·ionomer cements measured by two methods(μm)

  　　3 讨论

  　　染料渗漏研究是牙体微渗漏检测中的重要方法之一，根据染料扩散的方式分为顺向法和逆向法。本实验中采用顺向法，即将离体受试牙浸入特定浓度的染液中，一定时间后取出，测量染料沿窝洞壁渗透的深度，以评价充填材料与牙体组织的密合性。甲基蓝及酚红溶液为常用染料。染料法简便、直观 。目前用于染色法的检测仪器多种多样，但大多为普通光学显微仪器，如放大镜 ’ 、立体镜等。在传统的染色法检测中，测量结果多为分级评定或半定量，随着检测仪器的改进逐渐发展为定量。近年来在微渗漏的观测研究中引入了扫描电镜，图像较传统光学显微镜更清晰，但标本在制洞、充填后要经过一系列的技术处理方能观察，特别要经过脱水、干燥，牙体组织可因失水而体积收缩，造成牙齿与充填物之间产生缝隙 。这成为影响扫描电镜在微渗漏测量中应用的一个重要原因。因此，选择一种对标本无明显影响，测量方法简便可行，结果又较精确的仪器也许是提高微渗漏检测准确性的重要环节。

  　　金相显微镜也是一种光学显微镜，由显微镜主体、卤素灯和氙灯两套光源、电子控制系统、显微投影装置等构成，最高放大倍率2000×，可进行明场、暗场、偏振光和偏光相衬情况下的观察，目前多用于金属组织。它的优点是可以观测大体标本，无须做成切片。

  　　激光共聚焦显微镜是20世纪80年代发展起来的一种新型高精度显微镜，也是光学显微镜领域里的重要进展。与传统光学显微镜和普通荧光显微镜相比，在原理和功能上都有很大改进。它在倒置荧光显微镜基础上加装了激光扫描装置，利用计算机图像处理技术，以紫外或可见激光激发荧光探针，得到细胞或组织内部结构的荧光图像。它不仅具有高的平面分辨率，而且实现了高分辨率的纵深观察 。近年来在1：3腔医学研究中得到广泛应用， 1989年Watson率先利用激光共聚焦显微镜观察了粘接剂在界面的渗透情况，后逐渐应用于粘结界面观测 。由于以往的研究结果显示玻璃离子水门汀的边缘封闭性较优 ，因而在本实验中统一采用玻璃离子充填，将激光共聚焦显微镜与金相显微镜通过各自不同的标本制备过程，测得相应微渗漏数值，对两种方法进行比较研究。

  　　实验结果显示，无论充填传统型或树脂改性玻璃离子水门汀，激光共聚焦显微镜组所测数值均小于金相显微镜组，并且差别有统计学意义(P< 0．05)。原因可能主要为以下3点：(1)在标本制作过程中，二者都无须脱水包埋，在自然水化的状态即可检测，但激光共聚焦显微镜的标本用激光点扫描成像，形成所谓的“光学切片” ，进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加，形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，因此可用于观察一些表面不平的标本；金相显微镜的观测面要求必须平整，因而，标本处理中的砂纸打磨不可避免地影响检测面的原有状态，进而影响结果。(2)两者存在染色剂的差别。金相显微镜采用甲基蓝染色，镜下虽可观测到微渗漏引起的着色，但颜色较分散，边界不是非常清楚，测量时容易因为操作者的判断产生误差，将数值扩大或缩小；而激光共聚焦显微镜采用荧光染料，由于它只能检测到荧光物质，所以更具有特异性，一定程度上减小了此类误差的存在。 (3)罗丹明B是一种非水溶性荧光剂，将其溶解于 50％酒精溶液中作为荧光染色剂，可进一步减少实验中水质贮存液体对观察结果的干扰¨ 。

  　　4 结论

  　　激光扫描共聚焦显微镜和金相显微镜均可用于牙体充填材料边缘微渗漏的观测，但前者的标本制作要求简便，对荧光染色剂的检测特异性强，因而在观测牙体充填材料微渗漏的应用中优势明显。