唾液细胞外囊泡作为生物标志物诊断口腔疾病的研究进展

唾液细胞外囊泡作为生物标志物诊断口腔疾病的研究进展

唾液是由3对主要唾液腺和数百个次要小唾液腺产生的生物液体，其包含多种生化成分和理化特性，对维持口腔健康至关重要。对比血液诊断，唾液诊断更有优势：一是唾液的收集简单，无痛，经济且安全；另一个优势在于唾液每天可以多次取样且不易凝结，这使得重复分析和处理变得更加容易。然而，唾液诊断也存在不足，包括易污染、变异以及某些蛋白的存在（如淀粉酶）可掩盖唾液其他低表达蛋白。

细胞外囊泡（EVs）广泛存在于人体体液中，例如唾液、血液、尿液、乳汁、脑脊髓、羊膜和腹水。唾液细胞外囊泡反映相应起源细胞的核酸、蛋白质、脂质和代谢产物。越来越多的证据表明，唾液细胞外囊泡（外泌体）与口腔癌、牙周炎、口腔扁平苔藓（OLP）、干燥综合征（SS）等口腔疾病以及全身系统性疾病密切相关。

目前的研究方向更倾向于对唾液细胞外囊泡的研究，因为唾液细胞外囊泡不仅可以弥补唾液诊断的部分缺陷，还能同时结合唾液诊断的优势。因此，深入研究唾液细胞外囊泡的生物学行为和功能及其与疾病的相关性有助于发现相关疾病的发病机理，同时有望为疾病的早期诊断及预后评估提供新的液体活检生物标志物。

1.唾液细胞外囊泡

细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌或释放到细胞外环境的膜性小泡，其具有转移蛋白质、脂质和核酸的能力，从而影响受体细胞和亲本细胞的各种生理和病理功能，例如免疫监视、肿瘤微环境的改变和炎症的调节。细胞外囊泡根据其来源和生成过程大致可分为：外泌体、微囊泡和凋亡小体。

1.1 外泌体

外泌体（Exosomes）是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成直径40~100nm 的膜性脂质小囊泡。外泌体还可运载多种核酸，包括微小RNA、核糖体RNA、DNA、长链非编码RNA等，并参与受体细胞的信息交流，调控受体细胞功能。与其他体液中释放的外泌体相似，电子显微下，唾液外泌体是圆形的杯状囊泡，平均直径为30~100nm，根据其独特的大小和蛋白质组成，唾液外泌体可分为两种类型：外泌体Ⅰ和Ⅱ。通过电子显微镜测定，外泌体Ⅰ的平均直径为83.5nm，而外泌体Ⅱ的平均直径为40.5nm。

孙妍对唾液中细胞外囊泡的分离与蛋白质组研究表明唾液中外泌体涉及的生物学过程有体液免疫应答、吞噬作用、补体激活及其经典途径、蛋白激活级联和防御反应。目前唾液外泌体的分离有两种主要方法：经典物理超速离心（UC）法和ExoQuick-TCTM（EQ），后者为一种旨在沉淀外泌体的化学试剂。

1.2 微囊泡与凋亡小体

微囊泡（MVs，也称为脱落囊泡）是细胞受到相应刺激时，由细胞质膜向外出芽或脱落的形式释放的直径100~1000nm 的膜性小囊泡。微囊泡包含蛋白质、核酸和脂质等生物活性分子，微泡的结构可保护生物活性分子，并使这些分子从一个细胞转移到另一个细胞细胞。在缺氧、炎症反应、氧化应激等病理条件下微囊泡的产生数量明显增加。凋亡小体（apoptotic bodies）是细胞在程序性死亡即凋亡的过程中，通过发芽脱落或自噬体形成并释放的直径大于1~5μm 泡状小体，其由一个完整的质膜包围着细胞内的成分（既包含细胞器又包含细胞核碎片）。

2.唾液细胞外囊泡作为生物标志物对口腔疾病的诊断

2.1 唾液细胞外囊泡与口腔癌的诊断

口腔癌（oral cancer）的高发病率及其晚期表现是全球主要的医疗保健问题。世界卫生组织（WHO）将口腔癌的早期诊断和预防作为其主要目标。细胞外囊泡在不同的生理和病理条件下通过多种类型的细胞（包括肿瘤细胞）分泌到细胞外环境中。肿瘤来源的细胞外囊泡可通过促进癌症的进展、存活、侵袭和血管生成来影响肿瘤微环境。因此，如能在癌症形成前发现前驱性生物学分子的变化，就可能把癌变过程阻断在癌前阶段。

Zhong等报道了口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者的唾液微囊泡（SMVs）水平升高，而SMVs水平的升高与OSCC患者的临床表现和预后密切相关。同时在低分化OSCC患者中，凋亡SMVs与非凋亡SMVs的比例显著降低，预示OSCC患者的整体生存期较差，这项研究预示SMVs可能作为生物标志物诊断检测OSCC 潜力和意义。Gai等研究发现OSCC患者的唾液细胞外囊泡中两种miRNA（miR-412-3p和miR-512-3p）过度表达及两种miRNA（miR-302b-3p和miR-517b-3p）选择性的富集。这4种唾液细胞外囊泡中的miRNA均具有作为诊断OSCC生物标志物的潜力。

Zlotogorski-Hurvitz等分别从口腔癌患者和健康个体中分离出唾液外泌体，对比其形态和分子特征发现：口腔癌患者唾液外泌体四跨膜蛋白（CD63、CD9和CD81）的表达与健康个体存在明显差异，即CD81和CD9水平降低，CD63水平升高，表明唾液外泌体四跨膜蛋白可作为口腔癌早期诊断的潜在生物学标志物。

胡慧珍等采用高通量分析技术筛选出口腔癌外泌体差异mRNA，并进行生物信息学分析，研究外泌体差异表达的mRNA参与的信号通路，深入研究这些mRNA在肿瘤的发生、发展及转移过程的作用。Qadir等研究表明唾液或血液中的外泌体CEP55蛋白可作为头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）诊断和预后的非侵入性方式的癌症生物标记物。

2.2 唾液细胞外囊泡与牙周炎的诊断

牙周炎（periodontitis）是一种复杂的慢性炎症性疾病。在多数易感人群中，这种破坏性疾病会影响牙齿的支撑结构（牙骨质根、牙周膜和牙槽骨），导致牙齿松动并最终使牙齿脱落。Yu等研究牙周炎患者唾液外泌体PD-L1mRNA的表达，发现牙周炎患者唾液外泌体PD-L1mRNA的含量水平与非牙周炎患者相比存在明显差异。同时，唾液外泌体PD-L1mRNA的高表达与牙周炎的晚期进展有关，可以反映牙周疾病的进展，并可作为牙周炎在唾液中潜在的生物标志物。

Huang等收集了11例患有严重牙周炎的年轻患者和11例牙周健康受试者的唾液，通过蛋白质印迹评估仅在严重牙周炎的年轻患者组中表达的C6蛋白，牙周炎患者的唾液外泌体富含免疫相关蛋白，可能参与牙周炎发展过程中的免疫反应。Tobón-Arroyave等收集了104例牙周炎患者和45例健康对照者的唾液样本，旨在确定唾液外泌体相关四聚蛋白CD9和CD81与牙周临床状况的关系。结果表明：与健康对照组相比，在牙周炎患者中检测到唾液外泌体相关四聚蛋白CD9和CD81水平显著降低。

2.3 唾液细胞外囊泡与舍格伦综合征的诊断

舍格伦综合征（Sjogren syndrome，SS）又称干燥综合征，是一种慢性进行性自身免疫性疾病，最常见的症状是口干和干眼，这是由于淋巴细胞浸润到唾液腺和泪腺引起的，该病目前尚无确切有效的治疗方法。Aqrawi等分析10例原发性干燥综合征（pSS）和10名健康受试者，与健康受试者比，pSS患者组中Ficolin-1（FCN1）、CD44和膜联蛋白A4（ANXA4）蛋白表达上调，在唾液细胞外囊泡中变化最大的是FCN1蛋白，它是一种模式识别受体，参与先天免疫和补体激活。

Michael等分别从健康个体和干燥综合征患者唾液外泌体分离出miRNA，发现唾液外泌体miRNA不仅具有作为诊断标志物价值，而且还可以研究miRNA在各种唾液腺疾病的潜在病理生理过程中的作用，唾液外泌体某些特定的miRNA与唾液分泌异常或唾液腺周围炎症反应以及干燥综合征的口干症状有关。Hadavand等从pSS患者和健康受试者的腮腺外泌体中分离miRNA。使用TaqManmicroRNA定量PCR扩增，确认了3种miRNA（has-miR-203、has-miR-768-3p和has-miR-574-3p）的存在，研究表明hsa-miR-768-3p和hsamiR-574-3p能够根据唇腺灶性指数来区分pSS患者，其中has-miR-768-3p可能是该综合征潜在的诊断和预后的临床生物标志物。

2.4 唾液细胞外囊泡与口腔扁平苔藓的诊断

口腔扁平苔藓（OLP）是一种慢性黏膜炎性疾病。世界卫生组织将其描述为潜在的恶性疾病。OLP的发病机理仍有待充分阐明，但大量证据表明免疫和炎性因子具有重要作用。Byun等使用基因芯片分析和TaqMan定量聚合酶链反应（PCR）比较了16例OLP 患者和8例健康对照者唾液中外泌体miRNA图谱，发现唾液外泌体中miR-4484明显上调，并可能作为OLP的潜在诊断标记和治疗靶标。

3.总结

唾液检测是完全无创的检测，具有很好的应用前景。口腔疾病病灶与唾液密切接触，鉴定唾液中疾病特异性生物标志物（细胞外囊泡）是一种高效、经济且无创的分子诊断方法。唾液细胞外囊泡已被鉴定出具有临床相关信息的高信息量纳米囊泡，被公认与很多局部口腔和全身疾病的诊断检测存在密切相关。

尽管唾液检测具有这样的临床潜力，但由于其体积小，常规且可靠的分析仍然未完全明确。同时，许多唾液细胞外囊泡具体成分仍有待研究，具体的分子机制尚待阐明。目前尚不能确切的认识唾液细胞外囊泡与各种疾病的机制。因此，对唾液细胞外囊泡的研究将有助于加深在口腔疾病以及各系统疾病中潜在的诊断和治疗价值。